Конструирование эндонуклеаз рестрикции с фоторегулируемой активностью

• Автор: Ле Тхи Хиен
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 152 с. : ил.

Введение

Глава 1. Регулирование активности белков под действием света

Обзор литературы

1.1. Подходы к управлению активностью белков при облучении светом

1.1.1. Необратимая фотоактивация белков

1.1.2. Обратимое фоторегулирование белков

1.2. Методы введения остатка азобензола в состав пептидов и белков

1.2.1. Химическая модификация пептидов и белков

1.2.1.1. Синтез симметричных рсакционноспособных производных азобензола

1.2.1.2. Синтез асимметричных реакционноспособных производных азобензола

1.2.2. Введение азобензольного остатка в состав пептида в процессе пептидного синтеза
1.2.3. Введение азобензольного остатка в состав белка в процессе трансляции i vi
1.2.4. Введение азобензольного остатка в состав белка в процессе трансляции i viv
1.3. Регулирование активности белков при облучении светом различной длины волны
1.3.1. Фоторегулирование активности белков путем их модификации производными азобензола
1.3.1.1. Метод молекулярной пружины
1.3.1.2. Влияние облучения на формирование р шпильки в пептиде
1.3.1.3. Связывание ДНК с пептидом, содержащим мотив цинковый палец
1.3.1.4. Связывание активатора транскрипции САР с аденозин циклофосфатом
1.3.1.5. Эндонуклеаза рестрикции I
1.3.1.6. Неспецифическос воздействие па различные области в структуре белковой глобулы
1.3.2. Косвенное регулирование активности белков под действием света различной длины волны
1.3.2.1. Фоторегулируемые ингибиторы
1.3.2.2. Фоторегулируемые субстраты ферментов
1.3.2.3. Расщепление РНК рибонуклсазой Н с использованием ДНК, содержащей остаток азобензола
1.3.2.4. Взаимодействие антигена, содержащего азобензол, с антителом
1.3.3. Фоторегулирование активности белков путем их модификации
производными азобензола, содержащими лиганд для связывания с данным белком
1.3.3.1. Фоторегулирование калиевого канала
1.3.3.2. Фоторегулирование активности карбоангидразы
1.3.3.3. Фоторегулирование глутаматного рецептора
1.4. Заключение
Глава 2. Конструирование эндонуклеаз рестрикции с фоторегулируемой
активностью Обсуждение результатов
2.1. Конструирование и характеристика мутантных форм эндонуклеазы рестрикции БйоН
2.1.1. Выбор положений аминокислот в эндонуклеазе рестрикции БбоП для модификации азобензольными производными
2.1.2. Гидролиз ДНКсубстрата мутантными формами эндонуклеазы рестрикции БбоИ
2.1.3. Анализ реакционной способности остатков цистеина мутантных форм эндонуклеазы рестрикции 8ао
2.2. Синтез и свойств. производных азобензола
2.2.1. Синтез производных азобензола
2.2.1.1. Синтез симметричного производного азобензола
2.2.1.2. Синтез асимметричных производных азобензола
2.2.1.3. Синтез производного азобензола, содержащего олигонуклеотид
2.2.2. Оптические свойства производных азобензола
2.3. Модификация мутантных форм эндонуклеазы рестрикции ЯбоП производными азобензола
2.3.1. Взаимодействие производных азобензола 2.1 2.6 с остатками цистеина мутантных форм эндонуклеазы рестрикции БэдИ
2.3.2. Присоединение производных азобензола, содержащих олигонуклеотиды, к остаткам цистеина мутантных форм эндонуклеазы рестрикции БвоН
2.3.3. Выделение мутантных форм эндонуклеазы рестрикции БвоИ, содержащих олигонуклеотид
2.3.4. Оптические свойства мутантных форм эндонуклеазы рестрикции 8зо, модифицированных производными азобензола
2.4. Гидролиз ДНКсубстрата мутантными формами эндонуклеазы рестрикции ЗяоИ, модифицированными производными азобензола
2.5. Г идролиз ДИКсубстрата мутантными формами эндонуклеазы рестрикции ЭзоП, модифицированными производными азобензола при специфическом облучении
2.5.1. Г идролиз ДНКсубстрага мутантными формами эндонуклеазы рестрикции БбоП, модифицированными МАВОН, МАВСООН, МАВАт и МАВ5ис
2.5.2. Свойства мутантной формы эндонуклеазы рестрикции 8зо, модифицированной МЛВСуя, в присутствии ионов металлов
2.5.2.1. Взаимодействие хслатообразующих группировок модифицированных олигонуклеотидов, сближенных на комплементарной ДНКматрице
2.5.2.2. Гидролиз ДНКсубстрата мутантной формой эндонуклеазы рестрикции взоИ, содержащей хелатообразующую группировку
2.5.3. Гидролиз ДНКсубстрата мутантной формой эндонуклеазы рестрикции БзоН, модифицированной олигонуклеотидсодержащим производным азобензола
2.6. Эндонуклеаза рестрикции РуцИ с фоторегул ируемой активностью
2.6.1. Эндонуклеаза рестрикции Руц
2.6.2. Выбор положения в эндонуклеазе рестрикции РуиН для введения 4 азобензольных производных
2.6.3. Гидролмз ДНКсубстрата мутантными формами эндонуклеазы рестрикции 8 РуиН, модифицированными бисмалеимидазобензолом, при специфическом облучении
2.7. Сравнение двух подходов к модулированию активности эндонуклеаз 1 рестрикции под действием света
Глава 3. Экспериментальная часть
3.1. Реактивы и материалы
3.2. Приборы и методы
3.3. Общие методики
3.3.1. Синтез производных азобензола
3.3.2. Синтез олигодсзоксирибонуклеотидов
3.3.3. Введение Рмстки в олигонуклеотиды
3.3.4. Синтез протяженных ДНКдуплсксов
3.3.5. Выделение препаратов природной и мутантных форм эндонуклеазы 0 рестрикции БбоН
3.3.6. Проведение ферментативных реакций
3.3.7. Модификация белков
3.3.8. Фотоизомеризация производных азобензола
3.3.9. Гидролиз ДНКсубстратов модифицированными мутантными формами 7 эндонуклеаз рестрикции ЗбоП и РуиН при облучении УФ и голубым светом
Выводы
Список литературы


С высоким разрешением свет может мгновенно и точечно оказывать влияние только на целевой объект в клетке с минимальным разрушением остальных органелл клетки неинвазивнос свойство света. В природе известны хромофоры в составе белков, претерпевающие цистрансизомеризацию под действием света. В результате изомеризации происходит быстрое и обратимое переключение функциональных состояний белка. Классическим примером хромофора является ретиналь в белке опсин, который используется для преобразования света в электрические импульсы в глазах родопсин и как источник энергии для протонной помпы в бактериях бактериородопсин. Родопсин состоит из белковой части опсина и ковалентносвязанного с белком кофактора ретиналя рис. При облучении происходит изомеризация мсретиналя в тясретиналь, что приводит к изменению конформации опсина, а это в свою очередь активирует вбслок и запускает каскад взаимодействий, приводящих к передаче сигналов вторичными посредниками мессенджерами. Рис. Схематическое изображение структуры родопсина, б Цис и трансизомеры ретиналя. Данный обзор литературы посвящен обратимым и необратимым методам фоторегулирования активности белков. Основное внимание будет уделено обратимому регулированию активности белков под действием света. Для получения необратимо фотоактивируемых белков, как правило, проводится модификация ключевых аминокислот в активном центре фермента защитными группами, удаляемыми фотолизом 6. Блокирование центра связывания или каталитического центра позволяет инактивировать белок. Восстановление активности происходит быстро и необратимо рис. Рис. Схематическое изображение процесса получения необратимо фотоактивируемого белка. Чаще всего в качестве таких защитных групп используются 2нитробензильная схема 1. Метод временного блокирования активности белка был неоднократно описан многими авторами . В зависимости от поставленной задачи требования к инактивации белка варьируются. Указанный метод позволяет активировать белок только один раз. Последующая инактивация невозможна. Схема 1. Для обратимого регулирования активности белка молекулярный переключатель нужно ввести в этот белок таким образом, чтобы изменение геометрии переключателя приводило к значительному изменению активности белка. Ь под действием извне. Такая двойная стабильность молекулы может быть основана на разных свойствах способности к переносу электрона, к изомеризации, формированию комплекса и др. Для достижения обратимого перехода между двумя стабильными состояниями можно использовать внешние воздействия, такие, как свет, тепло, давление, магнитное или электрическое поле, изменение или химические реакции . Светочувствительные соединения, которые подвергаются обратимым переходам при облучении, являются хорошими кандидатами для создания фотопереключателей рис. Были изучены разные светочувствительные соединения, такие, как азобензолы, спиропираны, стерически затрудненные стильбены, производные тиоиндиго и др. Рис. Схематическое изображение молекулярного переключателя. А и В отражают 2 разные формы системы, стабильной в двух состояниях и регулируемой светом. Хгдлины волн, используемые для обратимого фотопереключения. Необходимыми условиями для применения молекулярного фотопереключателя являются его химическая многочисленные переходы между двумя формами не сопровождаются деградацией молекулы и термическая стабильность, а также возможность детектирования обеих форм молекулы. Для детекции фотохромной системы чаще всего используется спектрофотомстричсский анализ в видимой и ультрафиолетовой областях света. Большим классом фотохромиых соединений являются спиропираны, которые в результате гмстюнсизомеризации переходят в форму мероцианинов рис. Они обладают следующими оптическими свойствами 1 только мероцианин поглощает видимый свет 2 мероцианин более стабилен, чем спиропиран в водном растворе в темноте 3 энергетический барьер для перехода из мероцианина в спиропиран относительно низок 1. Рис. УФсветом рис. Процесс изомеризации происходит медленно 2 ч. Соотношение изомеров в результате облучения приближается к 1 .