Влияние замен аминокислотных остатков в зонах контакта субъединиц на структуру и каталитические свойства пирофосфатазы Escherichia coli

• Автор: Ефимова, Ирина Сергеевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 129 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

Сокращения и обозначения

Введение

Растворимые неорганические пирофосфатазы структура и функции обзор литературы

А. Семейство I

Каталитические свойства

Структура субъединицы

Олигомерная структура

Б. Семейство II

Каталитические свойства

Структура субъединицы

Олигомерная структура
Заключение
Экспериментальная часть
Результаты и их обсуждение
1 Влияние замен аминокислотных остатков в зонах контакта субъединиц
на четвертичную структуру пирофосфатазы
1.1 Контакт между тримерами
1.1.1 Диссоциация природной пирофосфатазы в кислой среде
1.1.2 Замены НБЗб и НвМО. Получение стабильной тримерной формы пирофосфатазы
1.1.3 Замены АБр и Абп
1.1.4 Холодовая инактивация мутантных форм пирофосфатазы
1.2 Контакт внутри тримера Туг и О1п
1.3 Одновременные замены в двух зонах контактов. Получение мономерной и димерной пирофосфатаз
2 Функциональная характеристика различных олигомерных форм пирофосфатазы
2.1 Тримерная форма
2.2 Димерная форма
2.3 Мономерная форма
2.4 Гексамерная форма Н6,Н03Рразы
2.5 Гексамсрные формы пирофосфатаз с заменами Азр и А5п
2.6 Кооперативность в катализе гексамерной пирофосфатазой с множественными заменами
3 Заключение Выводы
Список литературы


Полная структура ЕРРазы соответствует 5 остаткам УРРазы . УЕРРаз соответственно, участвующая, предположительно, в связывании фермента с митохондриальной мембраной . Только аминокислотных остатков консервативны для всех РРаз семейства I , и все они сосредоточены в области активного центра . Из них принимают непосредственное участие в процессе катализа , , , , , , , , , 2, 4, 1, 2 2,3, . Вторичная и третичная структуры. Пространственная структура мономера также является консервативной 5, , , , , . Все РРазы семейства I являются однодоменными белками артипа. Малые по размеру прокариотические РРазы образованы восемью рцепями и двумя аспиралями. Более протяженные и Сконцевые участки эукариотических РРаз рцспи 3, 4 и 9 в РРазе образуют дополнительный слой и взаимодействуют с рцепями 2 и 3 ядра молекулы. Сконцевые участки РРаз животных и грибов, вероятно, не существенны для каталитической активности и служат для стабилизации структуры фермента, в том числе для образования межсубъединичного контакта. Ядром структуры субъединицы является сильно скрученный пятицепочечный баррсль Рцспи 1, 4, 5, 6 и 7, в вершине которого расположена аспираль В, а дно образовано петлей между рцепями 5 и 6. Четыре заякоренных в барреле участка полипептидной цепи формируют очень большой активный центр, и на них расположены каталитически важных аминокислотных остатков. Эти участки также участвуют в формировании гидрофобного ядра барреля и в поддержании структуры активного центра 4. Длинный второй участок остатки содержит два из четырех важных основных остатков активного центра и . Третий участок остатки 52 содержит ключевые остатки активного центра триаду xxx остатки , и 0. Четвертый участок включает аспираль А, которая образует существенную часть стенки активного центра, участвует в формировании гидрофобного ядра молекулы и в образовании межсубъединичных контактов в бактериальных РРазах. Активный центр и механизм катализа. Активный центр представляет собой большую полость диаметром около А на поверхности фермента, причем в УРРазе он более компактен, чем в ЕРРазе . Дно активного центра гидрофобно, а большинство полярных остатков сгруппировано в отрицательно и положительно заряженные кластеры, расположенные на противоположных стенках активного центра. Отрицательно заряженный кластер важен для. О1и, Аяр1 , Аэр 0 и ЬуБ 32 принадлежит ключевая роль в организации активного центра . Полный каталитический цикл обратимой реакции гидролизасинтеза РР предполагает наличие шести центров связывания лигандов в активном центре РРазы. Согласно кинетическим данным, истинным субстратом РРазы является комплекс РР с одним или двумя ионами металла, который связывается в активном центре фермента, предварительно активированном связыванием двух ионов металла , . Структура комплекса фермента с пирофосфатом полностью подтвердила этот вывод 2. Центры связывания металловактиваторов М1 и М2 расположены в нижней части активного центра. Ион металла в центре М1 центр высокого сродства координируется боковыми цепями остатков АБр5 и Аэр2 5, 7, , и функционально изолирован от остальной части белка . Расстояние от М1 до еще одного лиганда остатка Аэр0, бидентатно координирующего также ион металла в центре М2, в ЕРРазе на 1,1 А больше, чем в дрожжевом ферменте, что объясняет ее меньшее сродство к М2 по сравнению с УРРазой . Малый вклад остатка АБр в связывание металла в центре М1 ЕРРазы подтверждается данными сайтнаправленного мутагенеза . Дополнительным лигандом М1 в дрожжевой РРазе является остаток Тгр3, связанный с ионом металла через одну из трех молекул воды в его координационной сфере. В РРазе из 5. Авр на 0, А в сторону от остатка Авр, ион металла в центре М1 координируется только двумя белковыми лигандами Аэр и Азр2 . Ион металла в центре М2 координируется остатком Аэр 0 и пятью молекулами воды, одна из которых связывает М2 с остатком О1и. В отсутствие субстрата ионы металла в центрах М1 и М2 расположены на расстоянии 4,9 и 6 А в У и ЕРРазах соответственно, и разделены двумя молекулами воды .