Взаимодействие нативного и химически модифицированного сывороточного альбумина человека с олиго- и полирибонуклеотидами

• Автор: Герасимова, Юлия Владимировна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 133 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

РАЗДЕЛ I. СЫВОРОТОЧНЫЙ АЛЬБУМИН ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С

ЛИГАНДАМИ И КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА обзор л итерату ры

1.1. Структура и взаимодействие сывороточного альбумина с лигандами

1.2. Каталитические свойства сывороточного альбумина

1.2.1. Сывороточный альбумин как гидролаза

1.2.1.1. Гидролиз сложных эфиров

1.2.1.2. Г идролиз тиоэфиров

1.2.1.3. Г идролиз производных фосфорной и фосфоновой кислот

1.2.1.4. Г идролиз амидов и амидофосфатов

1.2.1.5. Гидролиз Рлактамных антибиотиков

1.2.1.6. Гидролиз бснзизоксазола
1.2.2. Сывороточный альбумин как лиаза
1.2.3. Сывороточный альбумин как изомераза
1.2.3.1. Кетоенольная таутомерия и структурная изомеризация
эпоксисосдинений
1.2.3.2. Перемещение двойной связи
1.2.4. Сывороточный альбумин как оксидорсдуктаза
1.2.5. Роль лизина в реакциях, катализируемых сывороточным альбумином
1.3. Заключение
РАЗДЕЛ 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Материалы и методы
2.2. Адсорбция полирибонуклеотида па носителе
2.3. Разделение суммарного белка плазмы крови на аффинных сорбентах
2.4. Иммуноферментный анализ белков
2.5. Очистка альбумина
2.6. Получение гликироваиного и Лгомоцистеинилированного альбумина
2.7. Сравнительный анализ связывания нативного, гликироваиного и
ДГгомоцистеинилированного альбумина с полиА
2.8. Флуоресцентное титрование пикированного альбумина растворами
полирибонуклсотидов
2.9. Определение РНКгидролизующей активности альбумина i i
2 Введение метки по 5концевой фосфатной группе
олигонуклеотидов и транскрипта I IV1
2 Определение активности человеческого сывороточного альбумина в
реакции гидролиза олигодезокси и олигорибонуклеотидов
2 Аффинная модификация альбумина фосфорилирующим производным
2 Ферментативный гидролиз продуктов аффинной модификации
альбумина
РАЗДЕЛ 3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НАТИВНОГО И ХИМИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАНЫХ СЫВОРОТОЧНЫХ АЛЬБУМИНОВ АНАЛОГОВ КЛИНИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ ФОРМ БЕЛКА ЧЕЛОВЕКА С ОЛИГО И ПОЛИРИБОНУКЛЕОТИДАМИ Результаты и их обсуждение
3.1. Сывороточный альбумин как один из основных полирибонуклсотид
связывающих белков плазмы крови человека
3.1.1. Аффинная сорбция белков плазмы крови на полинуклсотид
содержащих сорбентах
3.1.2. Анализ белков, полученных аффинной сорбцией на полинуклсотид
содсржащих сорбентах
3.2. Влияние клинически значимых химических модификаций альбумина
на связывание белком гомополирибонуклсотидов
3.2.1. Получение i vi химически модифицированных сывороточных
альбуминов аналогов клинически значимых форм белка человека
3.2.1.1. Получение пикированного альбумина и его характеризация
3.2.1.2. Получение iVгомоцистеинилированного альбумина и его
характеризация
3.2.1.3. Влияние модификации альбумина на его вторичную структуру
3.2.2. Влияние пикирования и Агомоцистеинилирования на эффективность
связывания апьбумином полиА
3.2.3. Взаимодействие пикированного альбумина с гомонолинуклсотидами
3.3. РНКгидролизующая активность сывороточного альбумина
3.3.1. Некоторые механизмы гидролиза фосфодиэфирных связей в РНК
3.3.2. Анализ гомогенности используемого в работе препарата альбумина
3.3.3. Тестирование альбумина на РНКгидролизующую активность
3.3.4. Определение кинетических параметров реакции расщепления
фосфодиэфирных связей в РНК в присутствии альбумина
3.3.5. Субстратная специфичность альбумина в реакции расщепления
фосфодиэфирных связей в РНК
3.3.6. Зависимость эффективности расщепления фосфодиэфирных связей в
РК в присутствии альбумина от
3.3.7. Исследование влияния ионов металлов, связанных с человеческим
сывороточным альбумином, на его РНКгидролизующую активность
3.4. Влияние шинирования и АГгомоцистеинилирования на
РНКгидролизующую активность альбумина
3.5. Установление сайта связывания альбумина с олигорибонуклеотидами
3.5.1. Аффинная модификация альбумина фосфорилирующим аналогом
3.5.2. Анализ модифицированных пептидов методами гельэлсктрофореза и
МАЬОЕТОР массспектромстрии
ПРИЛОЖЕНИЯ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Таким образом, для установления причин исключительной полифункциональности человеческого сывороточного альбумина, обуславливающего его биологическую роль в организме, а также к связи с перспективой использования антисмысловмх олигонуклеотидов или интерферирующих РНК в качестве терапевтических средств, детальное изучение процессов взаимодействия как нативного человеческого сывороточного альбумина, так и его клинически значимых химически модифицированных форм альбуминов с такими важными молекулами как РНК представляется актуальным. Целью настоящей работы являлось исследование взаимодействия нативного и химически модифицированных форм гликированного и Агомоцистеинилированного человеческого сывороточного альбумина с РНК, а также сравнительный анализ способности альбумина и других белков нефракционированной плазмы крови связывать гомополирибонуклсотиды и их комплементарные комплексы. А, полиС, поли1, и полиС и их дуплексами полиЛ. МЛЬЕИТОР масссисктромсзрии и РЯМРспсктроскопии. РАЗДЕЛ 1. Сывороточный альбумин является одним из основных белков плазмы крови. Он синтезируется и секретируется в кровь клетками печени. Концентрация альбумина в крови составляет 0,6 мМ. Период полу жизни белка в кровяном русле суток 1. Гомология по аминокислотной последовательности сывороточных альбуминов среди млекопитающих составляет 1. Человеческий сывороточный альбумин содержит в своем составе только одну полипептид ну ю цепь, состоящую из 5 аминокислотных остатков. Масса белка составляет ,5 кДа. Первичная структура альбумина представлена кислотными и основными аминокислотными остатками Приложение А. Рис. Структура человеческого сывороточного альбумина по данным 6. По данным рентгеноструктурного анализа, молекула ША имеет форму сердца рис. А размером порядка xx А . Вторичная структура белка на представлена аспиралями, тогда как Рскладчатые структуры в молекуле нативного альбумина отсутствуют , . Третичную структуру альбумина стабилизируют дисульфидные связи, образующиеся за счет взаимодействия 8Нгрупп остатков цистеина и располагающиеся внутри девяти повторяющихся петлеобразных структур 1, . И, каждый из которых состоит из двух субдоменов Л и В . Субдомсны А и В образованы 6 и 4 аспиралями, соответственно, соединенных между собой гибкими петлями рис. А 1. Важной биологической функцией человеческого сывороточного альбумина считают его способность связывать и переносить широкий спектр как эндо, так и экзогенных соединений 8. Благодаря связыванию с альбумином повышается растворимость лигандов в плазме и устойчивость к окислению. Гак, например, . ИБА, который переносит их к клеткам ткани. Связывание альбумином некоторых токсичных веществ в крови может приводить к понижению их токсичности. Образование комплекса альбуминлиганд влияет на фармакокинетику многих лекарственных препаратов, увеличивая время их жизни в крови. Способность альбумина связывать вещества различного размера и химической природы реализуется благодаря конформационной лабильности молекулы белка, обеспечивающей возможность существования множественных сайтов связывания лигандов, каждый из которых отличается особой специфичностью. Основные сайты связывания лигандов в структуре НБА находятся в субдоменах НА и ША 8 рис. I А. Их принято называть сайт I и сайт II, соответственно . Сайт I. ПА рис. А и включающий аминокислотные остатки от Ьуз9 до С1и2, участвует в связывании дикарбоновых кислот, а также гетероциклических отрицательно заряженных соединений, несущих заряд в центре молекулы. С этим сайтом альбумина связываются билирубин , гематин , тестостерон , а также производные арахидоновой кислоты лейкотриены, проетагландины и громбоксаны 1. Среди лекарств, связывающихся с этим сайтом, выявлены варфарин , фуросемид , индомстацин , аспирин, пснициллины и другие 8. Сайт I представляет собой карман, внутренняя стенка которого образована гидрофобными аминокислотными остатками, а доступный для молекул растворителя вход окружен положительно заряженными боковыми радикалами основных аминокислот . Этот сайт достаточно большой, о чем свидетельствует тот факт, что с мим способны связываться такие крупные лиганды как билирубин . Структуры лекарств, связываемых сывороточным альбумином, приведены в Приложении Б.