Функциональный анализ ДНК-метилтрансфераз SssI и HhaI с помощью сайт-направленного мутагенеза и модифицированных субстратов

• Автор: Дарий, Мария Валерьевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 105 с. : ил.

Введение.
Глава 1. С5ДНКметилтрансферазы ННа1 и . Мутационный анализ прокариотических и эукариотических С5ДНКметилтрансфсраз Обзор литературы.

1.1. ДНКмстптрансфсраза НЬа1.

1.1.1 Общие сведения о структуре и механизме действия М.НЬа

1.1.2. Структурный и мутационный анализ М.НЬа

1.2. ДНКметилграисфераза 8зв1

1.2.1. Общие сведения о ферменте

1.2.2. Изучение механизма взаимодействия Мб с ДНК.

1.3. Мутационный анализ прокариотических и эукариотических С5ДНКмстилтрансфераз

Глава 2. Функциональный анализ ДИКметилтрансфераз и На1 с помощью сайтнаправлснного мутагенеза и модифицированных субстратов Обсуждение результатов.
2.1. Взаимодействие М.НЬа с ДНК, содержащей и трансангтЩаР,2 сЮаддукты в учаезке узнавания.
2.1.1. Дизайн модифицированных субстратов.
2.1.2. Связывание М.ЫЬа1 ВдРмодифицированных ДНКдуплексов.
2.1.3. Метилирование М.НЬа ВаРмодифицироватшых ДНКдуплсксов
2.1.4. Выявление контактов М.НЬа с ДНК, нарушающихся при введении
и трачсантиЩаР аддуктов.
2.2. Мутационный анализ ДНКметилтрансферазы ЗязТ.
2.2.1. Выбор аминокислотных остатков объектов мутационного анализа
2.2.2. Конструирование плазмид с мутациями в гене оюМ
2.2.3. Выделение и очистка МБэб и мутантных ферментов.
2.2.4. Подходы к изучению свойств мутантов
2.2.5. Функционатьпый анализ мутантов М.Язб
Глава 3. Экспериментальная часть
3.1. Реактивы и материалы.
3.2. Приборы и методы.
3.3. Общие методики.
3.3.1. Конструирование плазмид для продукции мутантов М.8.1.
3.3.2. Выделение М.8зя1 и мутантных ферментов.
3.3.3. Ферментативное 5фосфорилирование синтетических олигонуклеотидов
3.3.4. Выделение олигонуклеотидов из геля.
3.3.5. Определение концентраций активных молекул и мутантных
ферментов с помощью метода поляризации флуоресценции
3.3.6. Определение КА комплексов М.НЬа или и мутантных ферментов
с ДНК и Ас1оНсу с помощью метода поляризации флуоресценции
3.3.7. Определение КА комплексов М.НЬа1 с ДНК и Ас1оНсу с помощью метода торможения в геле.
3.3.8. Определение Кл комплексов или мутантных ферментов с ДИК и
АйоНсу методом прямого титрования фиксированного количества ДНК различными аликвотами фермента с помощью торможения в геле.
3.3.9. Определение начальных скоростей и каталитических констант реакции метилирования ВпРсодержащих ДНКдуплексов М.ПЬаТ.
3.3 Определение начальных скоростей метилирования ДНК М.Язя и мутантными ферментами.
Список литерату ры
Список сокращений
МТаза ДКметилтрансфераза Яаденозилмстионин аденозил.гомоцистсин
ii i область МТазы, ответственная за связывание с участком узнавания РСА рентгеноструктурный анализ 3 каталитический домен 3 ДМНББ 4,5димстокси2нитробензилбромид В1Р бензояпирен Г1ААГ полиакриламидный гель фермент дикого типа РАМ карбоксифлуорссцеин ДТТ 1,4дитиотреитол НСА бычий сывороточный альбумин ИПТГ изопропилрОтиогалактопиранозид ХС ксиленцианол ВРВ бромфеноловый синий ЭДТА этилендиаминтетраацетат натрия АТФ аденозинЗтрифосфат Тг8триспдроксиметиламиномеган ДСН додецилсульфат натрия М 5метил2дезоксицитидин константа диссоциации ксм каталитическая константа V0 начальная скорость реакции
Для обозначения нуклеотидных и аминокислотных звеньев, олиго и полинуклеотидов использовали символы, рекомендованные комиссией по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии II и Международного союза биохимиков I.
ВВЕДЕНИЕ


Бензоапиреп ВаР является одним из пол и циклических ароматических углеводородовзагрязнителей, широко распространенных в окружающей среде. В организмах, подверженных воздействию ВаР, отмечено образование множественных мутаций, что в конечном итоге может приводить к возникновению рака. Сам ВяР не является биологически активным, однако, при попадании в клетку он метаболизируется с образованием весьма реакционноспособных диолэпоксидов, которые могут ковалентно присоединяться к ДНК. При этом преимущественно модифицируются остатки гуанина с образованием стсрсоизомсркых що и трансаптиВаРЮ аддукгов. Известно, что траисантиЪаС аддукты плохо поддаются репарации. Вследствие этого, они могут вызывать нарушение функционирования различных ферментов, взаимодействующих с НК, в том числе МТаз. Однако на сегодняшний день молекулярный механизм действия ВяРповреждений наС5МТазы неизучен. Одним из объектов настоящей работы стала прокариотическая МТаза . Она узнает в ДНК последовательность и метилирует внутренний остаток цитозина участка узнавания подчеркнут. М. является одной из наиболее изученных 5МТаз для нее разрешена пространственная структура и достаточно подробно изучен механизм действия. Это явилось предпосылкой выбора М. ВаРповреждений ДНК на метилирование. Другим объектом работы стала . I уникальная прокариотическая МТаза, которая, как и эукариотические ферменты, узнает в ДНК последовательность . Благодаря этой особенности, . I может служить прекрасной моделью для изучения метилирования ДНК эукариотическими ферментами. Этот фермент был обнаружен еще в году, однако на сегодняшний день он практически не изучен. В частности, ист данных о пространственной структуре и практически отсутствуют данные о механизме действия . I. Известна первичная структура фермента, а также методом футнринтинга определены несколько функциональных групп ДИК. В нашей лаборатории методом компьютерного моделирования по гомологии была построена модель комплекса . IДЖI. Однако до сих пор функционального анализа аминокислотных остатков . I не проводилось. Целью работ,I явилось изучение влияния и ii2 аддуктор на функционирование ДНКмстилтрансферазы , а также определение функционально значимых аминокислотных остатков . В работе решались следующие задачи 1 определение влияния стереоизомерии V2 аддукта и его локализации в ДНК на различные стадии реакции метилирования ДНК МТазой 2 выбор аминокислот, предположительно существенных для функционирования . I, и сайтнаправленный мутагенез гена с целью получения мутантных форм . I 3 изучение влияния вводимых аминокислотных замен на связывание и метилирование ДНК МТазой и определение участия выбранных аминокислот в основных стадиях реакции метилирования. ГЛАВА 1. С5ДНКметил грансфсразы и . Общие сведения о структуре и механизме действия М. I Прокариотическая МТаза Ii входит в систему рестрикциимодификации i i и относится к классу С5МТаз 1. Она осуществляет перенос метальной группы на внутренний остаток цитозина последовательности в ДНК. М. использует кофактор 8аденозильметионин в качссгве донора метальной груши, рис. В процессе реакции превращается в алснозилгомоцистсин 2. I
2. Рис. Общая схема реакции метилирования. При этом М. ПЬа1 может вносить метильные группы как в еще не метилированную ДНК, превращая ее в полуметилированную стадия I на рис. Тем не менее, . В работах 5,6 было показано, что . ДНК процессивно, т. Однако степень процессивности . Затем . ДНК и может связаться как с той же, так и с другой молекулой субстрата 5. В состав . Да 3,7. В первичной структуре . С5МТаз рис. Порядок расположения этих мотивов в . ДНК 8. Рис. Консервативные мотивы в Функции мотивов указаны согласно 2,9. VIII xx, IX Е и X 2,9. Исходя из имеющихся для . РСА и мутационного анализа, были установлены функции консервативных мотивов рис. Мотив I входит в состав участка связывания кофактора. Данный мотив присутствует у многих зависимых белков, включая все ДНК, РНК и некоторые белковые метилтрансферазы . Помимо аминокислот из мотива I, в связывании кофактора также участвуют остатки из мотивов II, III, V и X . Мотив IV содержит инвариантный остаток , а мотив VI инвариантный остаток .