Получение модифицированных олигонуклеотидов для молекулярной диагностики наследственных и инфекционных заболеваний

• Автор: Лукьянова, Татьяна Александровна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 149 с. : ил.

Весьма удобными для этой цели оказались флуоресцентные метки, использование которых дало возможность увеличить чувствительность иммунохимических методов, а время анализа уменьшить до нескольких часов . Количественная оценка осуществляется с помощью градуировочной кривой, которую строят по стандартным образцам е известной концентрацией, проводя несколько параллельных измерений . Разнообразие объектов исследования от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, а также необычайно широкий круг задач, связанных с многообразием условий применения иммуноанализа, обуславливают разработку чрезвычайно большого количества вариантов этого метода . Гибридизационный анализ основан на реакции гибридизации между анализируемой нуклеиновой кислотой и зондом , . Метод применяется для определения вирусов и микроорганизмов по характерным для них нуклеиновым кислотам и для детекции отдельных генов в составе сложных генетических структур различных организмов. ДНК или РНКзондами. Само получение зондов или, точнее, их дискриминирующей части может вестись двумя основными путями. Вопервых, это могут быть комплементарные копии нуклеиновой кислоты анализируемого объекта полученные с помощью синтеза ДНК на одной из цепей детектируемой ДНК с помощью фермента ДНКполимеразы , . Достоинством такого подхода является то, что приготовление таких зондов не требует знания первичной структуры, т. Второй путь получения зондов химический синтез олигонуклеотидов с последовательностью, комплементарной к некоторому выбранному участку детектируемой нуклеиновой кислоты. Современные быстрые методы получения олигонуклеотидов с помощью автоматических ДНКсиитезаторов открывают возможность синтеза зондов к любым выбранным последовательностям. Достоинством олигоиуклеотидных зондов в тех случаях, когда выбрана мишень с известной последовательностью, является значительно большая скорость их гибридизации с мишеныо, а также легкость введения в синтетические олигонуклеотиды даже в ходе синтеза группировок, необходимых для последующего введения фрагментов, позволяющих детекцию малого количества зонда. Повидимому, оба подхода следует рассматривать как полноправные . В ряде случаев сочетание иммунохимических способов и метода олигоиуклеотидных зондов существенно расширяет информацию, т. ДНКи РНКзондов является не только альтернативой, но и дополнением по отношению к иммунохимическим методам . Флуоресцентные маркеры. Как и в случае иммунохимических способов, ключевыми моментами для метода ДНК и РНКзондов являются техника проведения анализа и метод детекции, которым в значительной мере определяется его чувствительность. Существует несколько различных типов маркеров. Радиоактивные методы маркирования и сейчас остаются довольно популярными. Хотя эти методы обладают достаточно высокой чувствительностью, они не лишены ряда недостатков, среди которых надо отметить высокую нестабильность радиоизотопов. Изза нестабильности радиоактивный зонд подвергается радиолизу раньше, чем радиоактивность упадет ниже приемлемого уровня что существенно ухудшит его опознающие свойства. А также очень важным является опасность радиоизотопов, препятствующая использованию их в клинических и диагностических целях необходимость дорогостоящего оборудования и квалифицированного персонала. Нерадиоактивные метки, какправило, являются флуоресцентными. Эти метки стабильны и могут использоваться в высоких концентрациях для увеличения скорости гибридизации. Химические группировки, вводимые в нуклеиновые кислоты, могут быть использованы не только для детекции специфической последовательности, но и для ее выделения. Преимущества, использования флуоресцентных меток в методе гибридных ДНК такие же, как и в случае иммуноанализа. Для детекции используют обычно спектральные методы, основанные на измерении либо поглощения света, либо флуоресценции . Во многих случаях флуоресцентный хромофор может быть введн в изучаемую молекулу либо путм образования химической связи, либо путем не ковалентного связывания за счт сил слабого взаимодействия гидрофобных, электростатических и др.