Протеиназы, иммобилизованные на криогеле поливинилового спирта, как катализаторы пептидного синтеза в органической среде

• Автор: Беляева, Анастасия Валерьевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 137 с. : ил.

Оглавление

Список сокращений

Введение

1. Модифицированные протеипазы как катализаторы синтеза

пептидов в органической среде обзор литературы

1.1. Механизм катализа пептидного синтеза протеиназами

1.1.1. Механизм катализа пептидного синтеза металлопротеиназами на примере термолизина

1.1.2. Механизм катализа пептидного синтеза сериновыми протеиназами

1.2. Влияние различных факторов на синтазную активность ферментов

1.3. Синтез пептидов, катализируемый модифицированными протеиназами

1.3.1. Синтез пептидов, катализируемый иммобилизованными протеиназами

1.3.1.1. Нековалентно иммобилизованные протеиназы в синтезе пептидов
1.3.1.2. Ковалентно иммобилизованные протеиназы в синтезе пептидов
1.3.1.3. Протеиназы, модифицированные альтернативными способами, как катализаторы пептидного синтеза в органической
1.3.2. Влияние содержания воды в реакционной среде на эффективность проведения пептидного синтеза, катализируемого модифицированными протеиназами
1.3.3. Субстратная специфичность нативных и модифицированных протеиназ в пептидном синтезе в органической среде
1.3.3.1. Субстратная специфичность металлопротеиназ в реакциях пептидного синтеза на примере термолизина
1.3.3.2. Субстратная специфичность сериновых протеиназ в реакциях пептидного синтеза в органической среде
Заключение
2. Обсуждение результатов
2.1. Получение и характеристика биокатализаторов на основе протеиназ, иммобилизованных на криогеле поливинилового спирта
2.1.1. Выбор протеиназ для шшобилизации
2.1.2. Получение носителей для иммобилизованных ферментов, базирующихся на криогелях поливинилового спирта
2.1.3. Иммобилизация протеиназ на криогеле поливинилового спирта
2.1.3.1. Иммобилизация трипсина на криогеле поливинилового спирта
2.1.3.2. Иммобилизация субтилизина, термолизина и хгшотрипсина на криогеле поливинилового спирта
2.2. Использование иммобилизованных ферментов в ферментативном пептидном синтезе
2.2.1. Использование иммобилизованного трипсина в ферментативном пептидном синтезе
2.2.2. Использование иммобилизованного субтилизина в ферментативном пептидном синтезе
2.2.3. Использование иммобилизованного термолизина в ферментативном пептидном синтезе
2.2.4. Синтез хромогенных и флуорогенных субстратов протеиназ под действием иммобилизованных ферментов
3. Экспериментальная часть
Материалы и методы
3.1. Иммобилизация протеиназ на криоПВСГ
3.1.1. Активация криогеля ПВС дивинилсульфоном
3.1.2. Активация криогеля ЛВС глутаровым альдегидом
3.1.3. Иммобилизация трипсина па активированном носителе
3.2. Изучение ферментативных свойств иммобилизованных
ферментов в водных растворах
3.2.1. Определение гидролитической активности иммобилизованного 8 трипсина
3.2.2. Изучение стабильности иммобилизованного трипсина в водном 8 буфере
3.2.3. Определение активности иммобилизованного субтилизина
3.2.4. Изучение стабильности иммобилизованного субтилизина в 9 водном буфере
3.2.5. Измерение ферментативной активности термолизина по 0 гидролизу ЛпрауауПеА
3.2.6. Изучение стабильности иммобилизованного термолизина в 0 водном буфере
3.2.7. Изучение стабильности иммобилизованного термолизина в 1 смесях органических растворителей
3.2.8. Определение активности иммобилизованного химотрипсина
3.3. Изучение иммобилизованных ферментов в синтезе пептидов
3.3.1. Синтезы, катализируемые иммобилизованным трипсином
3.3.1.1. Синтез 2РИеАЬеирМА
3.3.1.2. Синтез 2А 1аА 1аА РИерИА
3.3.2. Синтезы, катализируемые иммобилизованным субтилизином
3.3.2.1. Зависимость скорости синтеза от концентрации субстратов
3.3.2.2. Синтез 2А1аА1аЬеиРИерИА модельная реакция
3.3.2.3. Изучение зависимост и синтеза 2А 1аА 1а1еиРИерИА от 4 содержания ДМФ.
3.3.2.4. Конденсация 2А1аА1а1еиОМе 2А1аА1аЬеи0Н и РИерИА
3.3.2.5. Синтез еиРкерМА и 2А1аЬеиРИерМА
3.3.2.6. Синтез ВосЬеиРИерЫЛ
3.3.2.7. Синтез 2А1аА1аЬеирПА
3.3.2.8. Синтез 2А1аА1аАРИерПА
3.3.2.9. Синтез 2А1аА1аАгС1ирШ
3.3.2 Препаративный синтез 2А1аА1а1еирИА
3.3.2 Синтез 2ТИгА 1аТЬгАвррИА
3.3.3. Синтезы, катализируемые иммобилизованным термолизином
3.3.3.1. Синтез 2А1аА1аЬеирПА в смеси ацетонитрил 7 ДМФ
3.3.3.2. Изучение влияния концентрации иммобилизованного
термолизина на эффективность синтеза 2А 1аА1аЬеирИА
3.3.3.3. Изучение зависимости эффективности синтеза 2А1аА1а 8 ЬеирИА от концентрации исходных компонентов
3.3.3.4. Изучение зависимости эффективности синтеза 2А1аА1аЬеи 8 рЫА от содержания ДМФ
3.3.3.5. Изучение зависимости эффективности синтеза 2А1аА1аЬеи 9 рИА от содержания воды в реакционной смеси
3.3.3.6. Изучение зависимости эффективности синтеза 2А1аА1а1еи 9 рЫА от содержания ДМСО
3.3.3.7. Синтез 2А1аА1аЬеирИА, катализируемый одним образцом 9 иммобилизованного термолизина, в смеси ацетонитрил
ДМФ вода
3.3.3.8. Конденсация 2А1аА1а0Н и РИерИА
3.3.3.9. Препаративный синтез 2А1аА1а1еирИА
3.3.3 Конденсация 2АрОН и РкеОМе
3.3.4. Синтезы, катализируемые иммобилизованным химотрипсином
3.3.4.1. Синтез ОрРИеАаАМС
3.3.4.2. Изучение возможности повторного использования
иммобилизованного химотрипсина в синтезе арРИеАаАМС
3.3.4.3. Препаративный синтез С1рРИеА1аАМС
Выводы
Благодарности
Список литературы


Синтез пептидов, катализируемый протеипазами, является одним из наиболее перспективных подходов к получению практически важных биологически активных веществ. Проведение ферментативного пептидного синтеза в органических средах с низким содержанием воды способствует повышению эффективности реакций пептидообразования. Это обусловлено тем, что в присутствии органических растворителей более полно, чем в воде, реализуется сдвиг равновесия в сторону образования продуктов синтеза, уменьшается риск протекания побочных реакций гидролиза и возрастает растворимость гидрофобных соединений. В то же время органическая среда оказывает ингибирующее воздействие на ферменты, лишая их необходимой для осуществления каталитических функций гидратиой оболочки. Эффективным подходом для стабилизации протеиназ в органических средах является их ковалентная и нековалеитная фиксация на нерастворимых подложках. Однако протеиназы, закрепленные на носителе за счет физической адсорбции, находят ограниченное применение в пептидном синтезе изза опасности вымывания их в раствор и значительной инактивации. Ферменты, ковалентно фиксированные на инертной матрице, лишены этих недостатков. В этой связи актуальной представляется разработка эффективной биокаталитической системы, адаптированной к условиям синтеза пептидов в органической среде, на основе протеиназ, ковалентно иммобилизованных на подходящем макропористом носителе. Мы предлагаем новые биокатализаторы на основе протеиназ, иммобилизованных на криогеле поливинилового спирта. Целью работы являлось исследование протеиназ, иммобилизованных на криогеле поливинилового спирта, как катализаторов ферментативного синтеза пептидов в органической среде. При определенных условиях протеииазы могут выступать как катализаторы образования пептидной связи. Для этого используют большинство коммерчески доступных сериновых, металл о, аспартильных эндо и экзопептидаз 1. Проведение ферментативного пептидного синтеза в органических средах с низким содержанием воды способствует повышению эффективности реакций пептидообразования. Это обусловлено тем, что в присутствии органических растворителей более полно, чем в воде, реализуется сдвиг равновесия в сторону образования продуктов синтеза, уменьшается риск протекания побочных реакций гидролиза и увеличивается растворимость гидрофобных соединений. В то же время органическая среда оказывает негативное воздействие на каталитическую функцию ферментов, приводя к их инактивации 2. Одной из причин ингибирования фермента в органическом растворителе является прямой контакт растворителя с биокатализатором. Следствием такого контакта является нарушение гидратной оболочки фермента, а также изменение состояния ионизации полярных групп на поверхности фермента по сравнению с водной средой, что может приводить к частичному изменению его структуры. Существенную роль в стабилизации ферментов играет вода, а также факторы, вызывающие влияние на степень гидратации ферментов. ПАВ . Наиболее эффективным способом стабилизации протеиназ в неводиых средах является их модификация 3. Основное внимание будет уделено ферментам, иммобилизованным на нерастворимых подложках, а также протеиназам, ковалентно или нековалентно модифицированным сшивающими или полимерными реагентами. Механизм термодинамически контролируемого процесса рассмотрен на примере пептидного синтеза, катализируемого термолизином, а вариант кинетически контролируемого синтеза на примере катализа реакций пептидообразования сериновыми протеиназами. Термолизин КФ 3. Фермент проявляет исключительно эндопептидазную активность, специфически гидролизуя пептидные связи, амидный азот которых принадлежит аминокислотам с гидрофобными боковыми радикалами и не расщепляет их эфирные и амидные аналоги инитроанилиды, нафтиламиды и т. Б каталитический центр фермента входит четырехкоординированный атом цинка, аминокислоты i, Туг и . Поскольку термолизин, подобно другим металлопротеиназам, не образует ацилферментных промежуточных соединений, то он может принимать участие только в термодинамически контролируемых процессах.