Эндонуклеаза рестрикции EcoRII : Исследование каталитического механизма и структуры фермент-субстратного комплекса

• Автор: Кирсанова, Ольга Вячеславовна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 115 с. : ил

Введение.
Глава 1. Эндонуклеазы рестрикции типа II, взаимодействующие с двумя участками узнавания в ДНК.

обзор литературы. II

1.1. Эффект устойчивости некоторых молекул ДНК к расщеплению необычными эндонуклеазами типа II
1.2. Структурное сходство эндонуклеаз типов 1Е и 1 с классическими эндонуклеазами типа II и с ферментами других семейств.

1.3. Структу ра эндонуклеаз типа НЕ

1.4. Структу ра эндонуклеаз типа Е.

1.5. Взаимодействие эндонуклеаз типов НЕ и с ДНК

1.5.1. Неспецифическое взаимодействие с ДНК поиск участков узнавания

1.5.2. Специфическое взаимодействие с ДНК узнавание

1.5.3. Цис и транс активация.

1.5.3.1. Изгиб или петлеобразование ДНК при умсактивации
1.5.4. Роль нуклеотидных последовательностей, фланкирующих участокузнавания, во взаимодействии ЭР с ДНК зд
1.5.5. Каталитический механизм кинетика активированного расщепления ДНК и схемы реакций.
1.5.6. Механизм катализа расщепления фосфодиэфирных связей ЭР
1.5.6.1. Архитектура активного центра.
Глава 2. Эндонуклеаза рестрикции .ЕсяКИ исследование каталитического механизма и структуры ферментсубстратного комплекса обсужденнерезультатов.
2.1. Препаративное выделение эндонуклеазы со1Ш в виде ее гексагистидинового производного.
2.2. Кинетический анализ механизма расщепления ДНК эндонуклеазой АсоЯН.
2.2.1. Кинетические схемы.
2.2.2. Расщепление звенного субстрата с одним участком узнавания эндонуклеазой соШ1 в отсутствие или в присутствии тизвенного активатора
2.3. Определение количества межнуклеотидных связей, расщепляемых эндонуклеазой ЕсоЯН за один каталитический акт
2.4. Структурная организация активного коутлекса эндонуклеазы ЕсоКИ с ДНК.
2.4.1. Взаимодействие коротких ДНКдуплсксов, содержащих фотоактивные группы, с эндонуклеазой ЕсоЯН
2.4.1.1. Дизайн аналогов короткого субстрата
2.4.1.2. Субстратные свойства модифицированных ДНКдуплексов образование комплексов с эндонуклеазой ЕсоКЛ.
2.4.1.3. Зависимость ФМ эндонуклеазы соКЛ от положения фотометки в ДНКдуплексе, от ее природы, а также от времени облучения и интенсивности УФсвета
2.4.2. Определение структуры активного комплекса эндонуклеазы соШ
С ДНК.
2.4.3. Зондирование участков эндонуклеазы ЕсоК1, взаимодействующих с ДНК.
Глава 3. Экспериментальная часть
3.1. Материалы
3.2. Приборы и методы.
3.3. Общие методики.
3.3.1. Выделение ЭР ЕсоШ.
3.3.2. Выделение М.ЯсоЯД
3.3.3. Ферментативное 5фосфорилирование олигонуклеотидов
3.3.4. Химическое лигирование.
3.3.5. Гидролиз ДКдуплексов эндонуклеазой ЕсоЯЛ
3.3.5.1. Определение начальных скоростей гидролиза
3.3.5.2. Определение Кдисс ферментсубстратных комплексов соШ1 с
ДНК и соотношения каталитических констант клзкж
3.3.6. Комнлексообразование ЭР с ДНК
3.3.7. Фотоаффинная модификация ЭР ЕсоКИ Ш, ВИ или сасодержащими ДНКдуплсксами.
3.3.8. Расщепление ковалентных конъюгатов соШ1ОЫ химическими реагентами или протеолитическими ферментами
3.3.8.1. Подготовка ковалентных конъюгатов к реакциям расщепления химическими реагентами.
3.3.8.2. Расщепление с помощью НТЦБК
3.3.8.3. Расщепление с помощью ИБК
3.3.8.4. Частичное расщепление с помощью ХС.
3.3.8 5. Гидролиз протеолитическими ферментами
Выводы.
Список литературы


Введение. Глава 1. Эндонуклеазы рестрикции типа II, взаимодействующие с двумя участками узнавания в ДНК. Структурное сходство эндонуклеаз типов 1Е и 1 с классическими эндонуклеазами типа II и с ферментами других семейств. Структу ра эндонуклеаз типа Е. Цис и транс активация. Каталитический механизм кинетика активированного расщепления ДНК и схемы реакций. Архитектура активного центра. Глава 2. Эндонуклеаза рестрикции . ЕсяКИ исследование каталитического механизма и структуры ферментсубстратного комплекса обсужденнерезультатов. Препаративное выделение эндонуклеазы со1Ш в виде ее гексагистидинового производного. Кинетический анализ механизма расщепления ДНК эндонуклеазой АсоЯН. Кинетические схемы. Структурная организация активного коутлекса эндонуклеазы ЕсоКИ с ДНК. Субстратные свойства модифицированных ДНКдуплексов образование комплексов с эндонуклеазой ЕсоКЛ. С ДНК. Зондирование участков эндонуклеазы ЕсоК1, взаимодействующих с ДНК. Глава 3. Приборы и методы. Общие методики. Выделение ЭР ЕсоШ. Выделение М. Химическое лигирование. Фотоаффинная модификация ЭР ЕсоКИ Ш, ВИ или сасодержащими ДНКдуплсксами. Подготовка ковалентных конъюгатов к реакциям расщепления химическими реагентами. Частичное расщепление с помощью ХС. Выводы. Приложение. РМ рестрикциямодификация ЭР эндонуклеаза рестрикции РСЛ рентгеноструктурный анализ н. Для обозначения нуклеотидов, аминокислотных остатков, олиго и полинуклеотидов использовали символы, рекомендованные Комиссией по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии I и Международного союза биохимиков I. Гены систем рестрикциимодификации РМ составляют до 1 генома прокариотических организмов. Ферменты РМ типа II узнают определенные короткие последовательности в ДНК и катализируют расщепление обеих цепей эндонуклеазы рестрикции или метилирование гетероциклических оснований ДНКметилтрансферазы. Системы РМ играют ключевую роль в геномном метаболизме прокариот как в плане поддержания целостности генома защиты от чужеродной ДНК, так и ввиду их способности распространяться в геноме в качестве эгоистичных генетических элементов. Эндонуклеазы рестрикции ЭР типа II представляют собой обширное семейство ферментов с одинаковыми функциями, которые встречаются также у других белков, специфически взаимодействующих с ДНК, в частности у ферментов, обладающих нуклеазной активностью нуклеазы, рекомбиназы, резольвазы, грансиозазы, интегразы, белки, участвующие в репарации и др Следовательно, изучение механизма действия ЭР важно для понимания механизма узнавания и расщепления ДНК ДНКсвязывающими ферментами. Помимо того, ЭР могут служить идеальными объектами для изучения эволюционных взаимосвязей между ферментами различных семейств. Поскольку ЭР являются важнейшими инструментами генетической инженерии, информация о структуре и механизме функционирования этих ферментов необходима также для расширения их практического применения. М2 гидролизует фосфодиэфирные связи участка узнавания в положениях, указанных стрелками.