Олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие карбоксильную или альдегидную группу, и получение конъюгатов на их основе

• Автор: Качалова, Анна Владимировна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 124 с.

Введение химически активной группировки на бконец олигонуклеотида, а также в 2положение углеводного остатка представляется предпочтительным вариантом по сравнению с модификацией гетероциклических оснований и межнуклеотидных фосфатов, так как в этом случае вероятное искажение структуры двутяжевых НКфрагментов будет относительно незначительным. Кроме того, в случае модификации при С2атоме существует возможность встраивания как одного, так и нескольких модифицированных мономерных звеньев в любое заранее определенное положение олигомерной цепи.
На примере реакций с различными нуклеофильными агентами продемонстрирована высокая реакционная способность модифицированных олигонуклеотидов, содержащих карбоксильную или альдегидную группу. В случае олигонуклеотидов с бконцевой карбоксильной группой был разработан общий метод получения олигонуклеотидопептидов соединений, которые, согласно современным представлениям 1, могут способствовать проникновению в клетку антисмысловых олигонуклеотидов и, таким, образом, являться потенциальными терапевтическими агентами. Основная суть предложенного подхода к синтезу конъюгатов состоит в том, что образование амидной связи между заранее синтезированным пептидом с блокированной акарбоксильной функцией и защищенным олигонуклеотидом, содержащим селективно деблокированную и предактивированную карбоксильную группу, осуществляют после завершения автоматического олигонуклеотидного синтеза, при этом фрагмент ДНК остается иммобилизованным на нерастворимом полимерном носителе.
Работа включает обзор литературы, посвященный методам синтеза олигонуклеотидов, содержащих реакционноспособные электрофильные группировки.
3. ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ, СОДЕРЖАЩИЕ РЕАКЦИОННОСПОСОБНЫЕ ЭЛЕКТРОФИЛЬНЫЕ ГРУППИРОВКИ Литературный обзор

3.1. Введение

В настоящее время модифицированные олигонуклеотиды применяются как для решения разнообразных задач молекулярной биологии, так и при создании диагностических и терапевтических препаратов для лечения различных вирусных и наследственных заболеваний. В связи с этим необходимым представляется синтез конъюгатов олигонуклеотидов с другими соединениями, обладающими рядом уникальных свойств, то есть к фрагментам нуклеиновых кислот можно ковалентно присоединять репортерные молекулы, интеркаляторы, биологически активные пептиды и ферменты. Таким образом актуальной задачей становится получение одно или двутяжевых молекул ДНК, имеющих в своем составе группировки, реакционная способность которых отличалась бы от реакционной способности функциональных групп природных ДНК. Именно введение новых реакционных центров в состав олигонуклеотидной цепи позволяет успешно осуществлять синтез различных гибридных молекул.
На сегодняшний день существует большое число методов синтеза олигонуклеотидов, содержащих нуклеофильные группировки амино или тиогруппы 2, реагенты для введения которых в большинстве случаев коммерчески доступны. В то же время, получение олигонуклеотидов, содержащих реакционноспособные электрофильные группы карбоксильную или альдегидную представляется достаточно сложной задачей. Поэтому количество литературных данных по этой тематике весьма ограничено. Часть работ по синтезу бкарбоксилили альдегидсодержащих олигонуклеотидов была кратко рассмотрена в обзоре 2, посвященном более широкой теме синтезу различных производных фрагментов нуклеиновых кислот. Несмотря на это, необходимым представляется полный анализ и систематизация существующих работ, что, очевидно, будет способствовать дальнейшему развитию методов синтеза олигонуклеотидов данного типа.
Введение


В связи с этим необходимым представляется синтез конъюгатов олигонуклеотидов с другими соединениями, обладающими рядом уникальных свойств, то есть к фрагментам нуклеиновых кислот можно ковалентно присоединять репортерные молекулы, интеркаляторы, биологически активные пептиды и ферменты. Таким образом актуальной задачей становится получение одно или двутяжевых молекул ДНК, имеющих в своем составе группировки, реакционная способность которых отличалась бы от реакционной способности функциональных групп природных ДНК. Именно введение новых реакционных центров в состав олигонуклеотидной цепи позволяет успешно осуществлять синтез различных гибридных молекул. На сегодняшний день существует большое число методов синтеза олигонуклеотидов, содержащих нуклеофильные группировки амино или тиогруппы 2, реагенты для введения которых в большинстве случаев коммерчески доступны. В то же время, получение олигонуклеотидов, содержащих реакционноспособные электрофильные группы карбоксильную или альдегидную представляется достаточно сложной задачей. Поэтому количество литературных данных по этой тематике весьма ограничено. Часть работ по синтезу бкарбоксилили альдегидсодержащих олигонуклеотидов была кратко рассмотрена в обзоре 2, посвященном более широкой теме синтезу различных производных фрагментов нуклеиновых кислот. Несмотря на это, необходимым представляется полный анализ и систематизация существующих работ, что, очевидно, будет способствовать дальнейшему развитию методов синтеза олигонуклеотидов данного типа. ДНК, в том числе по 5 либо Зконцам. Данный признак и был выбран в качестве основного при рассмотрении методов синтеза модифицированных олигонуклеотидов. Нами кратко описаны эксперименты, подтверждающие реакционную способность введенных электрофильных группировок, и методы получения олигонуклеотидных конъюгатов. В разделе 4. ДНКдуплексов. Во всех обсуждаемых работах олигонуклеотиды были синтезированы автоматическим тведофазным амидофосфитным методом по стандартному регламенту 2,3 Мы не рассматриваем методы получения олигонуклеотидов, содержащих диальдегидную группировку, поскольку именно этой теме посвящен обзор 4. Также за рамками обзора остались подтверждение строения промежуточных и целевых соединений, так как в абсолютном большинстве работ осуществлен корректный анализ с использованием современных физикохимических методов ЯМРспектроскопии и массспектрометрии, и методы выделения модифицированных олигонуклеотидов обращеннофазовая, ионообменная ВЭЖХ, гельэлектрофорез в ПААГ, если они стандартны. Для введения карбоксильной группировки на бконец олигонуклеотида обычно используют модифицированное звено ненуклеозидной природы, которое присоединяют к растущей олигонуклеотидной цепи на последней стадии автоматического синтеза. При этом желательно, чтобы карбоксильная функция в процессе твердофазного синтеза была защищена, для чего ее превращают в сложный эфир. Гидролиз метилового эфира проводили до аммиачной обработки олигонуклеотида, поскольку при действии концентрированного водного раствора аммиака на сложный эфир происходит образование амида. Реакционную способность введенной алифатической карбоксильной группы подтверждали взаимодействием с аминами в присутствии диметиламинопропил3этилкарбодиимида 5 мМ раствор аминокомпонента, 4. Авторы отмечают, что при конденсации с нуклеофилами в этих условиях также происходит образование Лацилмочевины. Попытки избежать образования данного продукта за счет увеличения концентрации амина до 0 0 мМ или до 5. Авторы предполагают, что это происходит изза недостаточной концентрации свободной аминогруппы при таких значениях . Проблему удалось решить путем добавления в реакционную смесь имидазола, который взаимодействует с Оацилмочевиной с образованием активного промежуточного соединения имидазолида кислоты, затем реагирующего с амином. Более быстрое образование имидазолида предотвращает протекание перегруппировки Оацил в Vацилмочевину. Таким образом 5 были получены конъюгаты 5карбоксилсодержащего олигонуклеотида с аминами с количественным выходом. В работе 6 описан метод получения модифицированных олигонуклеотидов, содержащих на 5конце сложноэфирные группы 7 а, Ь Схема 2, постсинтетической обработкой которых 0.