Синтез катионных амфифилов липидной природы и создание на их основе липосомальных систем доставки нуклеиновых кислот

• Автор: Маслов, Михаил Александрович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 275 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Основные стадии транспорта нуклеиновых кислот с участием

катионных липосом

1.2. Внеклеточные и внутриклеточные барьеры

1.3. Модульные системы доставки НК.

1.4. Катионные амфифилы основные компоненты модульной системы

доставки НК
1.4.1. Моно и дикатионные амфифилы с длинноцепными алкильными или ацильными заместителями

1.4.2. Катионные производные фосфати дилхо ли на

1.4.3. Амфифильныс производные имидазола и пиридина.

1.4.4. Монокатионные липиды холестериново о ряда.
1.4.5. Поликатионные амфифилы.
1.4.6. Катионные амфифилы на основе аминокислот.
1.4.7. Геминиамфифилы
1.5. Стратегии по увеличению эффективности доставки
1.5.1. Клеточное нацеливание катионных липосом с использованием
различных лигандов
1.5.1.1. Углеводные лиганды для нацеливания на гепатоциты.
1.5.1.2. Фолиевая кислота для нацеливания на опухолевые клетки
1.5.1.3. Другие лиганды.
1.5.2. Улучшение интернализации систем доставки.
1.5.3. Увеличение высвобождения НК
1.5.3.1. рНчувствительные линкеры
1.5.3.2. Линкеры, чувствительные к действию внутри клеточных восстановителей.
1.5.3.3. Другие подходы к увеличению высвобождения НК.
1.6. Заключение
2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
2.1. Синтез катионных амфифилов на основе жирных спиртов, диглицеридов и холестерина
2.1.1. Монокатионные амфифилы.
2.1.1.1. Синтез амфифилов с карбамоильным, сложноэфирным и ацетальным линкерами
2.1.1.2. Синтез монокатионных амфифилов с углеводным звеном в качестве спсйссра.
2.1.2. Синтез поликатионных амфифилов на основе биогенного полиамина спермина
2.1.2.1. Синтез поликатионных амфифилов со сложноэфирным и карбамоильным линкерами
2.1.2.2. Синтез поликатионных амфифилов с ацетальным линкером.
2.1.2.3. Получение поликатионных амфифилов с дисульфидной связью
2.2. Катионные амфифилы на основе желчных кислот
2.2.1. Синтез моно и диаминоаналогов холевой кислоты.
2.2.2. Синтез катионных производных желчных кислот с карбамоильным и сложноэфирным линкерами.
2.3. Синтез катионных амфифилов с углеводными адресными лигандами
2.3.1. Синтез монокатионных углеводсодержащих амфифилов
2.3.2. Синтез поликатионных углеводсодержащих амфифилов
2.4. Синтез адресных компонентов модульных липосомальных
транспортных систем
2.4.1. Синтез нейтральных неогликолипидов
2.4.2. Синтез липофильных производных фолиевой кислоты.
2.5. Изучение физикохимических характеристик липосом и их комплексов с нуклеиновыми кислотами.
2.6. Изучение связи между структурой катионных амфифилов и их
биологическими свойствами. Создание липосомальных систем доставки НК.
2.6.1. Трансфицирующая активность монокатионных амфифилов
2.6.2. Трансфицирующая активность липосом на основе монокатионных амфифилов
2.6.3. Биологические свойства поликатионных амфифилов
2.6.3.1. Доставка нуклеиновых кислот с помощью углеводсодержащего поликатионного амфифила.
2.6.3.2. Доставка нуклеиновых кислот с помощью холсстсринсодсржащих поликатионных амфифилов.
2.6.4. Разработка липосомальной системы доставки НК в дендритные клетки
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
3.1. Основные методы.
3.2. Синтез катионных амфифилов с разлиным строением струтурных доменом
и способом их компоновки.
3.2.1. Синтез монокатионных амфифилов на основе жирных спиртов, диглицеридов и холестерина.
3.2.2. Синтез монокатионных амфифилов с углеводным спейсером.
3.2.3. Синтез поликатионных амфифилов на основе спермина.
3.2.3. Синтез катионных амфифилов на основе желчных кислот.
3.2.4. Синтез катионных амфифилов с углеводными лигандами
3.2.5. Синтез адресных компонентов модульных липосомальных транспортных систем.
3.3. Определение физикохимических характеристик липосом и липоплексов.
3.4. Исследование биологических свойств катионных амфифилов и липосом
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Однако, несмотря на свои защитные функции, молекулы ПЭГ могут негативно влиять на эффективность доставки НК, затрудняя высвобождение НК из эндосом , . Поэтому при конструировании ПЭГсодержащих систем доставки необходимо обеспечивать баланс между эффективной стерической стабилизацией и эффективностью трансфекции. Третьим модулем, который может существенно улучшить эффективность транспорта НК, являются липоконъюгаты с адресными лигандами к специфическим рецепторам клетокмишеней. Захват липоплексов клетками происходит по механизму эндоцитоза, поэтому наличие в системе доставки ПК адресных групп позволяет увеличить поглощение клеткамимишенями. Нацеливающие лиганды могут быть как низкомолекулярными соединениями например, фолиевая кислота, галактоза, липопротеины низкой плотности, небольшие пептиды, так и белками например, трансферрин и моноклональные антитела . Так как ковалентное связывание молекулы НК с адресным лигандом имеет ряд существенных недостатков изменение активности ПК и др. Структура КА представляет собой комбинацию двух основных, доменов гидрофобного и гидрофильного катионного, которые соединяются спейсерными группами с помощью химической связи линкера определенного типа рис. Каждый домен вносит свой вклад в активность молекулы КА и определяет ее поведение в организме. Гидрофобный домен участвует в формировании упорядоченных липосомальных структур и взаимодействии с клеточными мембранами, катионный связывает молекулы НК, а спейсерная группа обеспечивает подвижность катионного и гидрофобного доменов в пространстве. Большое значение имеет линкерная группа, так как ее устойчивость определяет токсичность молекулы амфифила в биологических системах. Гидрофобный Спейсер
Рисунок 1. В настоящее время синтезировано огромное количество разнообразных КА, которые показали очень расходящиеся результаты по трансфекции клеток, поэтому проследить точную взаимосвязь между структурой КА и его активностью довольно затруднительно. Многие i vi активные липосомы оказываются неэффективными i viv вследствие их взаимодействия с компонентами крови, нестабильности и различий в биораспределении. Далее приведен обобщенный анализ сведений о синтезе и строении КА, а также данные о влиянии структуры КА на проявляемую ими трансфицирующую активность. Транспорт плазмидной ДНК и РНК в эукариотические клетки впервые был осуществлен с использованием липосом на основе катионного глицеролииида 1 и , также предложен возможный механизм процесса грансфекции . Эффективность доставки НК с использованием была в 5 0 раз выше, чем при использовании метода кальцийфосфатпой преципитации. Впоследствии композиция мольн. Ivi I. Коммерчески доступным трансфектантом является липид АР 2 vi ii, который использовался для изучения морфологии комплексов с ДНК , в опытах ш viv и проходил клинические испытания по лечению муковисцидоза . Композиция соединения 8а I с холестерином I реагент, Ivi I. Синтез большинства катионных глицеролипидов основывается на небольшом числе химических превращений, приводящих к целевым веществам с приемлемыми выходами. Так, исходным соединением для синтеза 1 и его аналогов с служит 3,диметиламино1,2пропандиол, по гидроксильным группам которого вводят длинноцепные алкильные или ацильные заместители, а образующиеся соединения подвергают исчерпывающему апкилированию мети л йодидом 1 и 2, 2бромэтанолом 5 и 8а или Збромиропанолом 6а , . В случае соединений 9а, 1,2диалкилоксиЗЛг,ЛЧдиметиламинопропан взаимодействует с А3бромпропилфтапимидом с последующим удалением фталильной защиты гидразином . Юд СНэзС0
Ь i
0
0
0
Было установлено, что длина и тип алифатических цепей в молекуле катионных глицеролипидов влияют на эффективность трансфекции. Результаты трансфекции i vi с помощью КА с показали, что эффективность уменьшается в ряду соединений, содержащих следующие алкильные заместители дитетрадецил диолеил дигексадецил диоктадецил . Взаимосвязь между структурой КА, степенью гидратации и эффективностью трансфекции i viv была изучена на ряде тетраалкиламмониевых производных 2, 7, а, аi . Липиды смешивали с в соотношении и в комплексе с ДНК вводили внутритрахеатьно в организм мышей.