Изучение структурной и функциональной роли элементов центрального протуберанца большой субчастицы рибосомы

• Автор: Кипарисов, Сергей Владиславович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 105 с. : ил.

Содержание.

Список сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы

1.1. Морфология рибосомы

1.2. Особенности строения функциональных центров и структурных элементов рибосомы

1.2.1. Элонгационный цикл рибосомы

1.2.2. Пептиднлтрансферазный центр

1.2.3. Центр связывания элонгационных факторов

1.2.4. Декодирующий центр.

1.2.5. Асайтовый палец.

1.2.6. 5 рРНК
1.2.7. Спирали и
1.3 Передача сигнала в рибосоме
1.3.1. Декодирование, конформационные изменения при связывании
1.3.2. Транслокания, конформационные изменения при связывании
1.3.3 Передача сигнала
1.4 Заключение
2. Результаты и обсуждение
2.1. Исследование спирали рРНК.
2.1.1. Влияние мутации ДВ1а на ассоциацию субчастиц.
2.1.2. Эффективность зависимого синтеза i для рибосом, содержащих мутацию АВ1а
2.1.3. Эффективность отдельных стадий элонгационного цикла, для рибосом, содержащих мутацию АВ1а.
2.1.4. Стимуляция СТРазной активности функционатьными комплексами рибосом, несущих 1а мутацию.
2.1.5. Структурные изменения в рибосоме при мутации ДВ1а
2.2. Исследование 5 рРНК vii
2.2.1. Фенотип мутаций в 5 рРПК vii.
2.2.2. Эффективности программируемого сдвига рамки считывания для рибосом vii, несущих точечные мутации в 5 рРНК
2.2.3. Структурные изменения в рибосомах vii при мутациях в
5 рРНК.
2.3. Заключение.
3. Материалы и методы.
3.1. Исследование спирали рРНК .i.
3.1.1. Выделение рибосом .i несущих мутацию ЛВ1 а.
3.1.2. Определение зависимости степени ассоциации рибосомных субчастиц от концентрации 2
3.1.3. Эффективность зависимого синтеза .
3.1.4. Тестирование способности мутантных рибосом 1а осуществлять базовые стадии процесса трансляции т vi.
3.1.4.1. Получение .
3.1.4.2 Формирование комплексов
3.1.4.3. Анализ комплексов
3.1.5. Тестирование вТРазной активности , индуцированной различными рибосомными комплексами
3.1.6. Химический пробинг рибосомных структуры рибосом .i, несущих мутацию в спирали рРНК
3.1.6.1. Буферы и растворы
3.1.6.2. Модификация диметилсульфатом.
3.1.6.3. Модификация кстоксалем.
3.1.6.4. Модификация карбодинмидом
3.1.6.5. Выделение суммарной рибосомной РНК.
3.1.6.6. Реакция обратной транскрипции
3.2. Изучение 5 рРНК рибосом vii
3.2.1. Выделение рибосом, несущих мутацию в 5 рРНК.
3.2.2. Проверка наличия мутации в рибосомной РНК
3.2.2.1. Выделение рибосомной РНК.
3.2.2.2. Реакция обратной транскрипции
3.2.3. Измерение времени удвоения клеток
3.2.4. Расчет эффективности программируемого сдвига рамки считывания трансляции с помощью метода двух репортерных генов люцифераэ
3.2.4.1. Буферы и растворы
3.2.4.2. Определение соотношения активностей люцифераз
3.2.5. Пробинг структуры рибосом vii, несущих мутации в
5 рРНК.
4. Выводы.
Список литературы


Именно в этом регионе рибосомы располагаются высококонсервативные структурные элементы Асайтовый палец и 5Б рРНК, функциональному исследованию которых и посвящена данная работа. Обзор литературы. Морфология рибосомы. Бактериальная рибосома имеет массу около 2,6 2,8 , диаметр и коэффициент седиментации . Каждая субъединица сложный нуклеопротеидный комплекс, который по массе на состоит из белков и на из рибосомной РНК рРНК субъединица содержит одну молекулу рРНК рРНК 1,0 нукл и примерно белков, субъединица две рРНК 5 рРНК 0 нукл. РНК 2,0 нукл. С развитием методов электронной микроскопии в х годах появились первые работы, посвященные структуре бактериальной рибосомы 2, 3. В х, х годах были охарактеризованы формы большой, малой субъединиц и рибосомы . Реконструкции, полученные с помощью электронной микроскопии показали, что субъединица несколько продолговата. Ее длина составляет около 0 , а ширина около 0 . Первые изображения позволили морфологически различить голову субъединицы, которая соединена через шею с телом, которое, в свою очередь, имеет плечо и платформу. Из почти шарообразного основания выступают три периферических, почти цилиндрических, выступа или протуберанца 1 боковая доля, 1 ребро, центральный протуберанец или голова, боковой палочкообразный отросток так называемый 7 стержень Рисунок 1. Рисунок 1. Структуры , и субчастиц, полученные методом электронной микроскопии. Отмечены основные морфологические элементы рибосомы, которые различимы при данном разрешении. Рисунок 1. Центральный Голова протуберанец Внутренний 7
Рисунок 1. Структура рибосомы полученная методом криоэлсктрониой микроскопии. Отмечены основные морфологические элементы рибосомы. В х годах активно совершенствуются методы рентгеноструктурного анализа биологических макромолекул А. В году разработан формат файлов для хранения координат атомов, а позднее создана международная база данных структур биологических макромолекул i . Первые попытки кристаллизации рибосом и отдельных субчастиц рибосом термофильных организмов были предприняты в х годах . Проблема кристаллизации рибосом состоит в сложности получения однородных кристаллов, большая асимметрия которых не позволяла эффективно использовать кристаллографический подход на начальных этапах исследований. В последующие годы активно развиваются методы кристаллизации рибосом и РНКбелковых комплексов подробно обсуждено в , а также увеличиваются вычислительные мощности для математической обработки полученных дифракционных картин. Значительный прогресс был достигнут в кристаллизации и рентгеноструктурных исследованиях рибосомы i . Таким образом, к настоящему времени с большим разрешением расшифрованы структуры отдельных субчастиц из различных организмов и предложена структура рибосомы i Таблица 1. Таблица 1. Трехмерные структуры рибосом или рибосомных субъединиц, полученные с высоким разрешением мегодом РСЛ. Отдельно стоит упомянуть о получении детальной атомной структуры рибосомы, невозможность построения которой v из 5. Л карты электронной плотности были подробно обсуждены Рамакришнаном . В предложенной модели субчастицы структуры белков малой субъединицы были вписаны в карту электронной плотности рибосомы , рибосомная субъединица в составе включает в себя нерасшифрованные карты электронной плотности. Так, например, Са атомы белка 1 в полученной структуре частично перекрываются с атомами фосфора сахарофосфатного остова рРНК , . Ориентация двух доменов белка 1 в рибосоме отличается от наблюдаемого расположения этих доменов в белке в индивидуальном виде , или в комплексах 1 с рРНК . Структура рибосомы, полученная методом РСЛ хорошо совпадает с формой рибосомы, полученной методами с низкими разрешениями например криоЭМ , . Па данный момент в структуре рибосомы принято выделять следующие морфологические элементы Рисунок 1. Асайтовый патец . I, 2, 6, 9, . Некоторым из этих образований соответствует определенный домен в рРНК или рРНК. Так, например, платформа малой субчастицы полностью образована центральным доменом рРНК, тело и плечо 5доменом, голова 3большим доменом, а центральный протуберанец большой субчастицы образован в основном 5 рРНК.