Взаимодействие ДНК-полимераз с dNTP и их фотореакционноспособными аналогами

• Автор: Захаренко, Александра Леонидовна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 100 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Тины реагентов

1.1.1. Реагенты с реакционноснособной группой в грифосфатной части молекулы

1.1.2. Реагенты с реакционноспособной группой в рибозном кольце

1.1.3. Реагенты с реакционноспособной группой в азотистом основании

1.1.4. Природные субстраты как аффинные реагенты

1.2. Аффинная модификация ОТ ВИЧ

1.3. Аффинная модификации фрагмента Кленова

1.4. Аффинная модификация других ДНК и РНКполимераз
1.5. Использование аффинных реагентов для измерения кинетических
параметров ДНКполимеразной реакции
1.6. Изучение строения многокомпонентных комплексов методом аффинной
модификации
1.7. Фотосенснбилизнрованиая модификация ДНКполимераз
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Материалы
2.2. Методы исследования
2.2.1. Экспрессия и очистка ДНКиол и рпол человека
2.2.2. Экспрессия и очистка обратной транскриптазы ВИЧ и ее мутантных форм
2.2.3. Введение Рметки в 5 конец олигонуклеотида
2.2.4. Подготовка ДНКдуплскса к реакции синтеза ДНК. катализируемой ДНКиолимеразами.
2.2.5. Условия реакции синтеза ДНК
2.2.5.1. Реакция синтеза ДНК, катализируемая рнол
2.2.5.1.1. Изучение субстратных свойств аналогов
2.2.5.1.2. Нуклеотидил грансферазная реакция перенос на тупой конец
ОГЛАВЛЕНИЕ
2.2.5.1.3. Определение кинетических параметров для и ого производных
2.2.5.2. Реакция синтеза ДНК, катализируемая ДНКпол
2.2.5.3. Реакция синтеза ДНК, катализируемая ОТ ВИЧ и се мутантными формами
2.2.5.3.1. Изучение субстратных свойств и его аналогов
2.2.5.3.2. Определение кинетических параметров реакции синтеза ДНК
2.2.5.3.3. Подбор оптимальных концентраций ионов магния и марганца
2.2.6. Фотолиз аналогов
2.2.7. Фотоаффинная модификация ДНКполимераз реакционноспособными аналогами
2.2.7.1. Фотоаффинная модификация ДНКпол
2.2.7.2. Фотоаффинная модификация Рпол
2.2.7.2.1. Модификация Рпол анатогами
2.2.7.2.2. Модификация рпол и ДНКматрицы анатогами
2.2.7.3. Фотоаффинная модификация ОТ ВИЧ и се мутантных форм
2.2.7.3.1. Прямая модификация
2.2.7.3.2. Фогосенсибилизированная модификация
2.2.7.3.3. Определение эффективности фотомодификации ОТ ВИЧ с помощью 4 в присутствии разных сенсибилизаторов
2.2.7.3.4. Модификация ОТ ВИЧ долгоживущими продуктами фотолиза 4
2.2.8. МодификацияДНКматрицы фотореакционноспособными праймерами, синтезированными i i с помощью ДНКполимеразы
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Структуры и фотохимические характеристики аналогов
3.2. Взаимодействие ОТ ВИЧ и ее мутантных форм с сИЧТР
3.2.1. Подбор оптимальных концен траций двухвалентных ионов металлов
3.2.2. Субстратные свойства аналогов дИТР
3.2.3. Влияние замены аминокислоты на связывание бКТР
3.2.4. Влияние заместителя в азотистом основании на связывание нуклеотидов
3.2.5. Фотоаффинная модификация ОТ ВИЗ и ее мугантных форм
3.2.5.1. Прямая фотомодификация
3.2.5.2. Модификация ОТ ВИЧ и ее мутантных форм с помощью КАВ4ббШР
3.2.5.3. Фотосенсибилизированная модификация
3.2.5.4. Эффективность фотомодификации в присутствии различных сенсибилизаторов
3.2.5.5. Модификация ОТ ВИЧ долгоживущими продуктами фотолиза аналогов
3.3. Взаимодействие ДНКполимеразы Р с иЧТР
3.3.1. Субстратные свойства производных в реакции синтеза ДНК,
катализируемой рпол
3.3.1.1 Субстратные свойства ЫАВ4биТР
3.3.1.2. Субстратные свойства аналогов с различными
фотореакционноспособными группами
ОГЛАВЛЕНИЕ
3.3.1.3. Кинетические параметры реакции синтеза ДНК с использованием
производных
3.3.2. Аффинная модификация Рпол фоторсакциоиноспособными производными
3.3.2.1. Влияние матричного основания и двухвалентного катиона металла на аффинную модификацию Рпол
3.3.2.2.Модификация рпол фотореакционноспособными производными
3.4. Взаимодействие ДНКнолимсразы с
3.4.1. Субстратные свойства аналогов с различными фотоактивирусмыми группами в реакции синтеза ДНК, катализируемой ДНКполимеразой
3.4.2. Модификация ДНКполимеразы фотореакционноспособными аналогами
3.5. Модификация ДНКматрнцы фотоактивными праймерами,
синтезированными i i с помощью ДНКполимеразы.
ВЫВОДЫ.,.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Модификация ОТ ВИЧ долгоживущими продуктами фотолиза аналогов
3. ДНКполимеразы. ВЫВОДЫ. Ыазидо2,3,5,6тетрафторбензилиденаминосжсиметилкарбониламиноэтилдезоксирибоцитидин5трифосфат экю Казидо2,3. РЛВ4скШТР 5М2,3,5,6тетрафтор4ашдобензоилнюлс3ам1шонропенил1Г. ДПКполимсразы являются ключевыми ферментами процессов метаболизма ДНК. Основной функций ДНКполимераз является включение дезоксирибонуклеозид5монофосфагов в 3конец праймера комплементарно матрице. ДНКполнмеразы ведут синтез ДНК с поразительной точностью 1 8 см. Точный механизм отбора сПТР ДНКполимеразами остается неизвестным, несмотря на интенсивные исследования этих ферментов, в частности, на появление обширных данных о пространственной структуре ДНКполимераз и роли отдельных аминокислот, полученных с помощью различных методов. Первоначальная гипотеза о том, как происходит отбор нуклеотидов, была предложена Уотсоном, и Криком в году 2, 3. Они предположили, что водородные связи между парами оснований АТ и СС обеспечивают специфичность репликации ДНК. Однако данные, полученные за последующие лет, свидетельствуют о том, что разницы в свободных энергиях между комплементарными и некомплементарными пт ами оснований в водном растворе недостаточно для объяснения такой точности синтеза ДНК например, 4, 5 . Таким образом, полимеразы шрают ключевую роль в обеспечении точности синтеза ДНК. Тем не менее, ДНКиолнмеразы способны производить ошибочное включение природных нуклеотидов, а также использовать в качестве субстратов необычные формы оснований. По всей вероятности, такие пары достаточно стабильны и имеют геометрию, позволяющую проводить катализ. Так, например, 8ОсЮ в ьупконформации может быть встроен напротив Л матрицы, что приводит к замене АТ пары на 0С пару 6, 7. Это привело к предположению 8 и ссылки там, что селективность зависит в первую очередь от геометрии нар оснований. Метод аффинной модификации информативный способ получения данных о расположении и организации сайтов связывания субстратов или эффекторов на белковой молекуле. Метод основан на введении реакционноспособных групп в молекулу лиганда, не влияющих драматическим образом на узнавание и связывание их ферментом. Эффективность его применения проявляется в наибольшей степени при изучении сложных многосубстратных ферментов. В последнее десятилетие получен и применен для модификации ДНКполимераз широкий набор аналогов с1МТР, имеющих реакционноспособную группу в азотистом основании 9 . Все эти реагенты обладают субстратными свойствами и могут быть использованы для ферментативного синтеза фотореакционноспособных олигонуклеотидов. Подходом, увеличивающим селективность модификации биополимеров, является применение бинарной системы фотоаффинных реагентов и ссылки там. При облучении светом в специально подобранных условиях энергия изначально поглощается сенсибилизатором и затем передается на реагент, который в возбужденном состоянии модифицирует мишень. Недавно разработан подход, позволяющий проводить селективную модификацию каталитических субъединиц ДНКполимераз в присутствии РРА как представителя ДНКсвязывающих белков, не способных связывать сенсибилизатор , , с помошыо бинарной системы реагентов. Оба компонента системы являются аналогами ЮТР, при этом один из них несет фотоактивную, а другой фотосенсибилизирующую группу. Фотоактивный аналог встраивается в растущую цепь праймера за счет активности фермента, а сенсибилизатор связывается в сШТРсвязывающем центре ДНКиолимеразы. При облучении полученного комплекса УФсветом соответствующей длины волны сенсибилизатор поглощает энергию и переносит ее на фотоактивную группу. В использованных условиях облучения в отсутствие сенсибилизатора фотореагент не активируется. Активация фотореагента приводит к модификации фермента. Эффективность переноса энергии обратно пропорциональна шестой степени расстояния между фотоактивируемой и сенсибилизирующей группами , поэтому активация будет происходить эффективно только в случае, когда фотоактивирусмая группа находится вблизи сенсибилизатора, например, в специфическом комплексе с ферментом.