Структурно-функциональный анализ новых антимикробных пептидов семян ежовника обыкновенного : Echinochloa crus-galli

• Автор: Рогожин, Евгений Александрович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 130 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
1.ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность темы

1.2. Научная новизна исследований

1.3. Практическая значимость

1.4. Цели и задачи исследования Глава I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1. Характеристика антимикробных пептидов растений

2. Классификация антимикробных пептидов растений

2.1. Тионины

2.2. Дефензины

2.2.1. Классификация дефензинов

2.2.2. Структурные особенности дефензинов
2.2.3. Биологическая активность растительных дефензинов
2.3. Неспецифические липид-переносящие белки
2.4. Гевеин-подобные пептиды
2.5. Ноттин-подобные пептиды
2.6. Циклотиды
2.7. Снекины
2.8. Четырех-цистеиновые антимикробные пептиды
2.8.1 Антимикробные пептиды из нута (Macadamia integrifolia) и кукурузы (Zea mays)
2.8.2. Антимикробные пептиды из недотроги {Impatiens balsamina)
3. Общие принципы действия антимикробных пептидов
3.1. Механизмы антибактериального действия АМП растений
3.2. Механизмы антифунгального действия АМП растений
3.3. Механизмы действия дефензинов растений
3.4. Механизмы действия тионинов
3.5. Механизмы действия липид-переносящих белков
3.6. Механизмы действия гевеино-подобных пептидов
4. Применение антимикробных пептидов растений
4.1. Возможность клинического применения АМП растений
4.2. Возможность применения АМП растений в пищевой 39 промышленности
4.3. Использование АМП растений в сельском хозяйстве
4.3.1. Создание трансгенных культур, экспрессирующих гены АМП 41 растений
4.3.2. Перспективы применения АМП растений в качестве 44 биопестицидов
Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Оборудование
2. Реактивы
3. Биологический материал
3.1. Ежовник обыкновенный
3.2. Микроорганизмы
3.2.1. Грибы
3.2.2. Оомицеты
3.2.3. Бактерии
4. Выделение АМП из семян ежовника
4.1. Экстракция
4.2. Обессоливание тотального ацетонового осадка
4.3. Хроматографическое разделение обессоленного ацетонового 49 осадка
5. Методы структурного анализа АМП семян ежовника
5.1. Восстановление и алкилирование
5.2. Матричная ассоциированная лазерная десорбция/ионизация 51 (МАЛДИ) времяпролетная масс-спектрометрия
5.3. Гидролиз эндопротеиназой вІи-С
5.4. Установление аминокислотной последовательности
6. Аналитические методы исследования АМП семян ежовника
6.1. Гидролиз трипсином
6.2. Определение концентрации АМП спектрофотометрическим 52 методом
6.3. Получение флуоресцентной производной АМП из семян 52 ежовника
7. Методы исследования функциональной активности АМП
семян ежовника
7.1. Определение антифунгальной активности
7.2. Определение антибактериальной активности
7.3. Сканирующая лазерная конфокальная флуоресцентная 54 микроскопия
7.4. Сканирующая лазерная двухфотонная флуоресцентная (4-рі) 54 микроскопия
7.5. Сканирующая зондовая (атомно-силовая) микроскопия (ACM)
Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Выбор объекта исследований
2. Оптимизация метода выделения АМП из семян ежовника
3. Выделение АМП из семян ежовника
3.1. Выделение Ec-AMP-D 1 и Ec-AMP-D2
3.2. Выделение EcAMPl
4. Структурная характеристика АМП семян ежовника
4.1. Установление первичных структур Ec-AMP-D 1 и Ec-AMP-D2
4.1.1. Сравнение первичных структур Ec-AMP-D 1 и Ec-AMP-D2 с 66 гомологами
4.2. Определение первичной структуры EcAMPl
4.2.1. Сравнение первичной структуры EcAMPl с гомологами
4.3. Определение пространственной структуры EcAMPl
4.3.1. Сравнение третичной структуры EcAMPl с другими 71 пептидами
5. Функциональная характеристика АМП семян ежовника

принимает участие в регуляции клеточного цикла у гриба Neurospora crassa (Lobo et al., 2007).
Изучение взаимодействия дефензина NaDl цветков душистого табака (Nicotiana alatä) с грибом Fusarium oxysporum с использованием методом флуоресцентной микроскопии показало, что дефензин проникает в гифы гриба приводя к нарушению проницаемости цитоалазматической мембраны, затем вызывает образование гранул в цитоплазме и последующую гибель клеток. Таким образом, он действует не только на мембранные структуры гиф гриба, но и на внутриклеточные мишени (van der Weerden et ab, 2008; 2010).
Механизм антибактериального действия дефензинов растений бактерии не изучен.
Для дефензина люцерны (Medicago sativa) MsDEFl показано, что он блокирует Са2+-каналы клеток млекопитающих, и, вероятно таким же образом действует на грибы (Spelbrink et ab, 2004), а у дефензина кукурузы (Zea mays) - выявлена способность ингибировать работу №+-каналов.
3.4. Механизмы действия тионинов
Биологическая активность тионинов обеспечивается через формирование пор в биологических мембранах, приводящее к нарушению их структурной целостности и гибели клеток.
В исследованиях на дрожжах S. cerevisiae было показано, что тионин семян пшеницы (Т. aestivum) вызывает увеличение проницаемости мембран клеток дрожжей, о чем свидетельствовало выделение в окружающий раствор ионов К+, РО43'. (Guihard et ab, 1993). Для гриба Neurospora crassa, выращенного на среде, содержащей 14С-изоаминомасляную кислоту, показано, что добавление тионина зерновок ячменя (Hordeum vulgare) вызывает отток 14С-изоаминобутирата из мицелия (Thevissen et ab, 1996). При этом установлена прямая зависимость между действующей концентрацией тионина и степенью ингибирования роста гриба, что указывает на связь с