Изучение теломеразного комплекса дрожжей Saccharomyces cerevisiae

• Автор: Щербакова, Дарья Михайловна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 136 с. : ил.

Содержание.
1. Введение

2. Обзор литературы. Теломсразнмй комплекс структура и функции

2.1. Введение. Теломераза сложный РНП комплекс.

2.2. Теломераза как фермент.

2.3. Основные компоненты теломеразного комплекса и .

2.3.1. Теломеразная обратная транскриптаза .

2.3.2. Теломеразная РНК

2.4. Функционирование тсломеразы i viv. Вспомогательные белки теломеразного комплекса

2.4.1. Защитная функция тсломеразы.

2.4.2. Координация удлинения теломер тсломеразой и других процессов i viv

2.4.3. Субстрат теломеразы теломера
2.4.4. Локализация теломеразы в зависимости от стадии клеточного цикла.
2.4.5. Вспомогательные белки теломеразного комплекса дрожжей и 3. Регуляция теломеразы в клеточном цикле
2.4.6. Удлинение теломер теломеразой i viv.
2.4.7. Регу ляция количества теломеразы. Деградация компонентов теломеразы.
2.5. Заключение.
3. Результаты и обсуждение
3.1. Изучение возможности димеризации теломеразы дрожжей . vii
3.1.1. Постановка задачи.
3.1.2. Создание дрожжевых штаммов, экспрессирующих 1 РНК с аптамерной вставкой, а также системы для тестирования функциональности модифицированной 1 РЫК и изучения возможности димеризации тсломеразы
3.1.3. Тестирование фукциональной активности 1 РЫК с аптамерной вставкой i viv
3.1.4. Аффинное выделение теломеразы за лптамерную вставку в 1 I I
3.1.5. Анализ димеризации теломеразы.
3.1.6. Обсуждение полученных результатов.
3.2. Изучение обнаруженного взаимодействия теломеразного комплекса дрожжей с биотинилированным белком.
3.2.1. Постановка задачи.
3.2.2. Обнаружение биотиннлированного компонента в составе теломеразного комплекса.
3.2.3. Анализ фракционированных по массе теломеразных комплексов на присутствие биотиннлированного белка
3.2.4. Обсуждение полученных результатов
3.3. Заключение.
4. Материалы и методы.
4.1. Реактивы, биопрепараты, буферные растворы, олигодсзоксирибонуклсотиды, штаммы
4.2. Методики, использованные в работе.
4.2.1. Клонирование
4.2.2. Получение плазмидных конструкций, используемых в работе
4.2.3. Создание штамма 6 .
4.2.4. Анализ 1 РНК с помощью ОТПЦР
4.2.5. Создание штаммов ., i, i 1 . i2,
, 7, , 4 и ., i , используемых в работе
4.2.6. Выделение теломеразы с помощью хроматографии на ДЭАЭцеллюлозе
4.2.7. Детекция тсломеразной активности
4.2.8. Выделение теломеразы с помощью хроматографии на стреитавидинсефарозе. .
4.2.9. Фракционирование
4.2 Детекция биотинилированных белков с помощью Вестерн блоттинга
5. Выводы
Список литературы


Для активности теломеразы дрожжей i viv помимо компонентов корового фермента 2 и 1 РНК, абсолютно необходимы белки 1 р и , а также компонент теломерного хроматина, не входящий в состав комплекса 3 . Штаммы с делениями компонентов теломеразного комплекса , 2 3, 3 и проявляют сенессенсфснотип . При делении клеток тсломеры постепенно укорачиваются и через 0 поколений они становятся короткими настолько, что НС выполяняют свои функции, деление клеток прекращается, наступает клеточное старение сснессспс . Активность теломеразы очень тонко регулируется. С помощью скринингов обнаружено, что в дрожжах 5. При этом к сенессенсфенотипу приводят не только перечисленные выше делеции, но еще одновременное удаление генов 1 и I , о чем речь пойдет ниже. Одна из функций белка 1 р установлена. Он, взаимодействуя с теломерным белком 3 и одновременно с 1 РНК в составе теломеразы, привлекает теломеразу на теломеру . Показано, что, этот белок, возможно, проявляет еще и активирующие функции . Гомолог этого белка I обнаружен у человека, показано, что он входит в состав теломеразы , но его роль до конца не ясна. О функциях белка 3 много споров, точный механизм его действия в составе теломеразы пока не ясен. В данный момент в нашей лаборатории и в других группах обнаружены интересные свойства этого белка, которые могут прояснить его роль. Показано, что в отличие от 3 оба белка и 3 являются субъединицами теломеразы рис. Возможно, взаимодействие недостаточно прочное или динамичное. РНК 1 , , . Характер связывания 3 с теломеразным коплексом до сих пор до конца не ясен. В более ранних работах сообщалось, что для связвания 3 с активной теломеразой необходим 2 . Также есть косвенные свидетельства того, что 3 взаимодействует с концевым доменом 2 . В более поздней работе показано, что 3 связывается с предварительно собранным теломеразным комплексом, включающим в себя 2, и 1 РНК 3. В теломеразный комплекс дрожжей входят также белки и Кибелки рис. РНК в комплексе . Кибелки, связывая 1 РНК, привлекают теломеразу на теломеру в 1фазе клеточного цикла, когда теломераза неактивна . Если связывание Ки с 1 РНК нарушить, то теломеры укорачиваются, что указывает на значимость этого взаимодействия . Но сенессенсфенотипа при этом не наблюдается. Вопрос о функционазьной значимости привлеченя теломеразы на теломеру в 1 фазе будет рассмотрен ниже в разделе, посвященном регуляции теломеразы i viv. Рисунок 1. Строение теломеразного комплекса дрожжей. Параллельно с исследованиями теломеразы дрожжей . Очень интересны дрожжи i . Строение теломер этих дрожжей близко строению теломер высших эукариот , а теломеразный комплекс во многом похож на комплекс дрожжей . В этом организме был обнаружен также ортолог , для которого было показано участие не только в удлинении теломер теломеразой, но и в защите теломерных концов . Интересные результаты с точки зрения понимания механизма работы теломеразы обнаруживаются и при изучении теломеразы дрожжей v i. В этих дрожжах были идентифицированы гомоги всех белков, входящих в состав теломеразного комплекса дрожжей . РНК 1 содержит один из самых длинных матричных участков, н. Гомологи белков 1 р, 2 и 3 vii были найдены также у дрожжей i i , 2 3 . Дрожжи . Поэтому изучение теломеразы этих дрожжей представляет собой не только теоретический интерес. У . КЬ, состоящие из регулярных теломерных повторыов длиной в н. Анализ нокаутных штаммов по генам 2, . Но некоторые различия, все же, имеются. Фенотип клеток с делениями компонентов теломеразного комплекса дрожжей С. Геломеры . Тсломераза непростой объект для изучения. Ее количество в клетке очень мало. Недавно с помощью метода ОТПЦР в реальном времени удалось посчитать, сколько молекул I РНК приходится на клетку дрожжей vii . Оказалось, что в гаплоидной клетке содержится молекул, что меньше, чем число концов хромосом в поздней фазс всего хромосом дрожжей . В диплоидных клетках дикого типа содержится молекул на клетку. Если же в диплоидном штамме одну аллель удалить, то окажется всего молекул 1 РНК в клетке.