Конструирование и синтез искусственных рибонуклеаз на основе 1,4-диазабицикло(2.2.2) октана и имидазола

• Автор: Коневец, Дмитрий Александрович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 146 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ..

ВВЕДЕНИЕ.

НЕПРИРОДНЫЕ КАТАЛИЗАТОРЫ ГИДРОЛИЗА РНК.

ТИПИЧНЫЕ СТРУКТУРЫ АКТИВНЫХ ЦЕНТРОВ И МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ПРИРОДНЫХ ФОСФОЭСТЕРОЛИТИЧЕСКИХ
ФЕРМЕНТОВ.

ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ КОНСТРУИРОВАНИЯ ИСКУССТВЕННЫХ

РИБОНУКЛЕАЗ

Дизайн каталитических доменов.

Виды РНКсвязывающих доменов

ПРИМЕРЫ РЕАЛЬНЫХ КОНСТРУКЦИЙ.

Металлозависимые искусственные рибонуклеазы.
Металлонезависимые искусственные рибонуклеазы.
Искусственные РНКазы, содержащие каталитические цен тры различной природы.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ ИЗ ОБЗОРА ЛИТЕРАТУРЫ И ЗАДАЧИ ДИССЕРТАЦИИ.
ДИЗАЙН ИСКУССТВЕННЫХ РИБОНУКЛЕАЗ ХАВ,ЕкСт.
СИНТЕЗ ИСКУССТВЕННЫХ РИБОНУКЛЕАЗ ХЛВ,ЬкСт.
Общая стратегия синтеза
Конструирование активированных эфиров, содержащих РНК
связывающий домен.
Сшивка РНКсвязывающсго и каталитического центров.
Получение полизарядных искусственных рибонуклеаз ХЛпВЬкСт
Дизайн и синтез усеченных искусственных рибонуклеаз.
Характеризация синтезированных соединений.
Возможности варьирования доменной структуры, природы доменов и
геометрии молекулы в рамках предложенной стратегии синтеза
ГИДРОЛИЗ РНК ИСКУССТВЕННЫМИ РИБОНУКЛЕАЗАМИ ХАпВ,ЬкСт
Основные закономерности процесса гидролиза РНК в присутствии
синтезированных искусственных рибонуклеаз.
Зависимость гидролитической активности искусственной РНКазы от
строения каталитического центра.
Зависимость рибонуклеазной активности конъюгатов от суммарного
положительного заряда субстратсвязывающего центра
Зависимость рибонуклеазной активности конъюгатов от расстояния
между каталитическим и РНКсвязывающим доменами.
Наличие всех доменов необходимое условие высокой
каталитической активности искусственной РНКазы
РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРОДОЛЖЕНИЯ РАБОТ ПО ФУНКЦИОНАЛЬНОМУ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЮ ИСКУССТВЕННЫХ РИБОНУКЛЕАЗ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ.
Материалы.
Общеупотребительные методы
ОРГАНИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ.
БЛАГОДАРНОСТИ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В активные центры многих ферментов, расщепляющих фосфоэфирные связи, таких как, фосфомоно, фосфодии фосфотриэстеразы, в качестве кофакторов входят ионы таких металлов, как М, Са, Ъп, Со, Мп, Ре и , координированные боковыми функциональными группами аминокислот346. Значительно реже встречаются ферменты, активные центры которых не содержат ионов металлов, например, рибонуклеазы А и Т. Прогресс, достигнутый в области изучения строения и механизмов функционирования природных ферментов, гидролизующих РО связи в различных субстратах, нашел отражение в ряде обзоров, опубликованных в последние годы67,8,9. Общие представления о ферментативном катализе как о совокупности сопряженных процессов позволяют предположить, а в некоторых случаях и экспериментально доказать, наличие в активных центрах природных рибонуклеаз нескольких структурнофункциональных блоков, отвечающих за активацию атакуемой и атакующей частиц, а также за стабилизацию переходного состояния и уходящей группы. Чаще всего предполагается, что гидролиз РО связей происходит благодаря той или иной форме кислотноосновного катализа. В отличие от гидролиза С0 связей, расщепление РО связей но механизму нуклеофильного катализа встречается очень редко,. В качестве атакующей нуклеофильной частицы наиболее часто выступает молекула воды, однако в ряде случаев это могут быть алкил гидроксильные группы, например, 2гидроксильная группа рибозы или 1группа гидроксилсодержащих аминокислот. Значительно реже в качестве нуклеофильной частицы выступает БНгруппа цистеина. В качестве атакуемой частицы, согласно наиболее вероятному механизму гидролиза фосфоэфиров ЕА,, выступает атом фосфора. При этом реакция протекает через образование отрицательно заряженного интермедиата с пентакоординированным атомом фосфора Рис. Р0 ШН
Рисунок 1. В настоящее время наиболее детально изученными металлонезависимыми рибонуклеазами являются рибонуклеаза А и рибонуклеаза Т. Установлено, что оба фермента расщепляют фосфодиэфирные связи в РНК по механизму внутримолекулярной переэтерификации. Схема классического двухступенчатого механизма каталитического кислотноосновного гидролиза фосфодиэфирных связей в рибонуклеиновых кислотах РНКазой А Рис. Ключевыми стадиями являются отрыв основанием атом азота имидазола Н52 протона от 2гидроксильной группы рибозного остатка и перенос протона от протонированного атома азота имидазола Ня на кислород уходящей группы. Рисунок 2. У прошнмиГс мехамшм дейсшя рибонуклеази Л. На стадии гидролиза циклофосфата происходит регенерация этих двух каталитически активных сайтов протонирование имидазола i 9 вследствие нуклеофильной атаки атома фосфора молекулой воды и депротонирование имидазола i 2 с переносом протона на образующуюся гидроксильную группу фосфомоноофира. Детали взаимодействия аминокислотных остатков в активном центре как между собой, так и с субстратом постоянно уточняются,, однако несомненно, что при гидролизе РНК рибонуклеазой А в одном акте катализа одновременно принимают участие два кислотноосновных каталитических центра на основе имидазола с различным расположением в пространстве относительно РНКмишени один в форме донора про гона, а другой в форме его акцептора. Металлозависимые ферменты, гидролизующие фосфодиэфирные связи в различных субстратах, также часто содержат несколько комплексообразующих доменов, сформированных аминокислотными остатками, то есть в каталитическом акте одновременно принимают участие два или даже три иона металла. Так, в одном акте гидролиза, осуществляемого нуклеазой Р1 из iii ii или фосфорилазой С из i Рис. За, задействованы три иона цинка два атома цинка участвуют в гидролизе периплазматической 5нуклеотидазой из Е. Рис. В активных центров пурпурных кислотных фосфатаз обнаружены также два иона металла одного и того же железа, но в различных степенях окисления в ферментах млекопитающих и двух различных металлов 3 и 7лг в растительных ферментах Рис. Зв. При исследовании механизма действия ферментов, содержащих в активном центре всего один ион металла например, стафиллококковая нуклеаза Рис. Т Д КНМ Н 7 Г
продолжение рисунка см.