Изучение посттрансляционных модификаций вирусных белков с использованием масс-спектрометрических подходов

• Автор: Серебрякова, Марина Васильевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 99 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.9

2.1 Использование массспектрометрии при изучении белков.

2.2 Основы Iвремяпролетной массспектрометрии белков и пептидов

2.2.1 I получение газофазных ионов биополимеров

2.2.2 Фрагментация пептидов, индуцированная I

2.2.3 Изучение природных модификаций белков

2.2.4 Времяпролетная система разделения ионов и их детекция

2.2.5 Разрешение и точность Iвремяпролетных массспектрометров

2.2.6 Получение массспектров фрагментации.

2.3 Белок оболочки X вируса картофеля.
2.3.1 Строение белка оболочки X вируса картофеля.
2.3.2 Возможные модификации белка оболочки X вируса картофеля
2.4 Гемагглютинин вируса гриппа типа А
2.4.1 Строение вирусных частиц гриппа типа А
2.4.2 Строение гемагглютинина и его участие в слияниис клеткой хозяина.
2.4.3 Ацилирование Сконцевого участка гемагглютинина жирными кислотами и возможная роль этой модификации белка
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
Препараты X вируса картофеля.
Препараты вируса гриппа типа А.
Модельные пептиды
Массспектрометрия.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
4.1 Массспектрометрическое определение положения углеводных остатков
в белке оболочки Хвируса картофеля, штамм 3, и его мутанта.
4.1.1 Определение возможных модификаций белка оболочки.
4.1.2 Определение точного положения сахарных остатков
4.2 Изучение ацилирования цистсинов Сконцсвой области гемагглютинина вируса гриппа штаммов i8, АХ и Vi жирными кислотами.
4.2.1 Выделение и идентификация Сконцевых фрагментов
4.2.2 Изучение лабильности тиоэфирной связи под действием
восстанавливающих агентов
4.2.3 Определение соотношения количеств пальмитиновых и стеариновых остатков в Сконцевой области гемагглютининов разных штаммов.
4.2.4 Изучение направленности ацилирования трех цистеиновых остатков Сконцевой области гемагглютинина разными жирными кислотами
5. ВЫВОДЫ.
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
1. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Он также вовлечен в транспорт вирусной РНК по растению, влияет на возникновение резистентности растения картофеля к заражению, значим для регуляции трансляции на разных стадиях инфекции. Факт Огликозилирования белка оболочки бьш установлен в году, но до последнего времени не были изучены ни тип сахаров, ни их локализация, ни степень гликозилирования белка, ни их возможная значимость. Это делает углубленный анализ этой модификации белка оболочки безусловно актуальным. Во второй части работы изучались модификации Сконцевого участка малой субъединицы гемагглютинина вируса гриппа А. Гсмагглютинин гликозилированный поверхностный белок вируса. Он представляет собой гомотример, каждый мономер которого состоит из двух цепей, связанных между собой дисульфидным мостиком. Легкая цепь заякорена в мембрану своим Сконцевым участком. Основные исследования структурных и функциональных особенностей гемагглютинина связаны с изучением его эктодоменов. Для ряда штаммов получены рентгеноструктурные данные, проливающие свет на пространственную организацию экспонированной на поверхность части белка. В то же время, практически отсутствуют данные о структуре заякоренного в оболочке вириона Сконцевого гидрофобного пептида. На сегодня опубликована единственная работа на искусственно синтезированном пептиде, встроенном в липосому, направленная на выяснение его свойств и структуры. Фрагмент гемагглютинина, остающийся в вирусной мембране после обработки вириона протеазой бромелаином, содержит трансмембранный домен и небольшой внутривирионный участок. Исследование типа и степени ацилирования представляется очень важным, так как остатки жирных кислот могут служить для ориентации трансмембранных доменов в липидном бислое, способствовать тримеризации гемагглютинина, участвовать в образовании пор слияния в процессе инфицирования клеткихозяина или во взаимодействии гемагглютинина с внутренними вирусными белками. Цель и задачи исследования. Работа посвящена отработке методов применения МАЫЛТОР для изучения двух из распостраненных модификаций природных белков Огликозилирования и ацилирования цистеиновых остатков высшими жирными кислотами. ЦКЗ Хвируса картофеля, являющегося типичным представителем группы потексвирусов из семейства нитевидных вирусов растений. Для этого получить и проанализировать пептидные карты белка, определить степень гликозилирования и тип присоединенных сахарных остатков, разработать подходы к точному установлению сайтов гликозилирования. Сконцевого фрагмента лгкой цепи гемагглютинина трх штаммов вируса гриппа А АРиеПо Шсо8, АХ и АРРУЛУеуЬпсе. Для этого выделить и идентифицировать Сконцевые пептиды, определить степень ацилирования трех консервативных цистеиновых остатков этой области белка и тип присоединяемых жирнокислотных остатков, изучить стабильность тиоэфирной связи в условиях получения массспектров и в присутствии восстанавливающих агентов в процессе выделения белка. Впервые с использованием массспектрометрических подходов проведен структурный анализ белка оболочки X вируса картофеля природного штамма 1ЖЗ и его БТмутанта, у которого все остатки серина и треонина Ыконцевой области белка заменены на остатки глицина или аланина. Огликозилировании белка оболочки природного штамма. Выделены и методами массспектрометрии охарактеризованы Сконцевыс пептиды легкой цепи гемагглютинина вируса гриппа типа А, содержащие трансмембранный домен и внутривирионный участок. Исследования проведены на трех вирусных штаммах i8, АХ и Vi. А не только пальмитиновой, но и стеариновой кислотой. Определены количественные соотношения ацилирующих эту область белка пальмитиновых и стеариновых остатков, которые оказались существенно различными для трех вирусных штаммов. Практическая значимость работы заключается в разработке методологических подходов к изучению неустойчивых при проведении массспектрометрического анализа модификаций белков, в разработке способов выделения и детскции трансмембранных пептидов. В ходе исследования также показана достаточная для получения массспектров фрагментации устойчивость тиоэфирной связи и исследована лабильность этой связи под действием известных восстанавливающих агентов.