Изучение структуры малых нематричных РНК эукариот и архебактерий

• Автор: Рождественский, Тимофей Станиславович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 144 с.

Оглавление.

Список условных сокращений.

Введение.

Нематричные РНК

Обзор литературы

Структурная организация ВС Р1К

Локализация ВС РНК в тканях

Ген ВС РНК и его локус.

Регуляция транскрипции гена ВС РНК крысы.

РНКбелковые взаимодействия для ВС РНК.

Седиментация ВС РНП в градиенте концентрации раствора сахарозы

Плавучая плотность ВС РНП в градиенте концентрации раствора и
Определение качественного состава ВС Р.
ПолиА домен ВС РНК связывается с белком РАВР
Предполагаемая функция ВС РНК
ВС РНК ингибирует реакцию трансляции i vi в лизатах ретикулоцитов
кролика.
Эффект ингибирования специфичен для эукариотической системы
трансляции
Структурные особенности ВС РНК, отвечающие за ингибиторный эффект. Делеции или блокирование полиА домена приводит к понижению уровня
ингибирования.
Природные малые цитоплазматические РНК, содержащие полиА участок, также обладают ингибиторной активностью.
Эволюция гена ВС РНК.
Ген ВС1 РНК обнаружен исключительно в геноме грызунов.
Происхождение ВС1 РНК
Ду пликация гена ВС1 РНК у морской свинки.
Консерватизм гена ВС1 РНК.
Ген ВС1 РНК как мастерген для Шповторов.
Ген ВС1 РНК мастерген
Механистические взгляды на ВС1 РНКI мастерген.
Геномика и рибономика тРНКА,а мыши.
Результаты и обсуждение
Идентификация траискрипционко активных генов тРНКА1а мыши
Разработка метода выделении и секвснирования ВС1 РНК из тканей
мозга мыши.
Ссквеннрование ВС1 РНК мозга мыши.
Анализ вторичной структуры ВС1 РНК.
Взаимодействие ВС1 РНК с аланилтРНКсинтетазой . i
Рибономика архебактерий i.
Создание и анализ библиотеки кДНК.
Анализ уровня транскрипции генов предполагаемых мнмРНК
Группа 1 мнмРНК с известной первичной структу рой или структурным
мотивом.
Группа II мнмРНК с неизвестным прототипом первичной структуры или структурного мошна.
Рибономика от крывает связь между сплайсингом нитронов архебактерий и
процессингом рРНК
Идентификация кДНК проду ктов лигирования РНК в ВНВмогивах для
нре рРНК и рРНК . i.
Гомологичные кДНК проду кты лигирования РНК в ВНВмотивах прерРНК
. i.
Доказательства присутствия лигированных РНК у .i и . i
Структурный анализ РНК .i и 1 РНК . i.
Взаимодействие процессированных мнмРНК с белком
Материалы и методы.
Материалы
Методы.
Получение компетентных клеток и их трансформации.
Клонирование генов тРНКЛ1и мыши
Создание рекомбинантных ДНК использованных для синтеза ВС1 РНК, мутантов ВС1 РНК, тала ВС1 РНК и ВС1 РНК с дополнительной
последовательностью на Зг конце.
Создание рекомбинантных ДНК использованных для синтеза РНК из Л.
i, . i и . i
Клонирование и выделение рибосомною белка 7 из . i и . i
Получение кДНК Ма с суммарной РНК тканей мыши
Ссквенированис
Разделение суммарной РНК.
Гибридизация по нозерну
Выделения ВС1 РНК
Транскрипция РНК i vi
Реакции радиоактивного мечения РНК по концу.
Транскрипция РНК i vi с включением 2 I
Реакции радиактивного мечения праймеров
Химическая модификацияпроб1шг РНК с использованием КЕ, СМСТ и
Химический гидролиз иробннг РНК с помощью ацетата свинца.
Энзиматический гидролиз пробинг II рнбонуклеазой яда кобры V Реакции обратной транскрипции для локализации химических модификаций и энзиматического гидролиза
Комнлексообразование ВС1 РНК с алаиилтРНКсинтстазой.
Взаимодействие мнмРНК с рибосом ным белком Ь7Ае из Р.аЬу.ш и А.ифия
Идентификация клонов, содержащих кДНК мнмРНК
Праймеры.
Определение позиций пссвдоуридилировании на 8 и 8 рРНК А.идодо
Выводы.
Список цитируемой литературы


Результаты таких скринингов оказались поразительными. Все они показали, что нмРНК очень много и их число совершенно недооценивалось ранее. Идея о том, что вплоть до настоящего времени обширный класс генов мог избежать идентификации, выглядела очень провокационной, если не сказать еретической. Самые первые примеры идентификации нмРНК касались относительно распространенных РНК. Конечно, в первую очередь, это были гРНК и рРНК, далее были обнаружены богатые РНК сплайсосом, РНК РНКазы Р, 7 РНК сигналузнающих частиц , далее появлялись все новые и новые отдельные примеры, в том числе ВС1 РНК. Немного подробнее остановимся на малых ядрышковых РНК мядРНК, идентификация которых для архебактерий была впервые проведена в настоящей работе. Ядрышко очень богато мядРНК, большинство из которых имеют длину около 0 нуклеотидов. Некоторые из них участвуют в процессинге рРНК, но большинство принимают участие в модификации рРНК. На основании довольно слабой гомологии первичных структур почти все мядРНК можно отнести к двум семействам С и НАСА. РНК. В обоих случаях каталитическую функцию, повидимому, выполняют белки метилаза и псевдоуридинсинтетаза, связанные в комплекс с мядРНК, а адресность обеспечивается комилсментарностью РНК. Среди таких РНК найдены гомологи для человека, дрожжей, растений, трипаносом. Методами биоинформатики и иммунопреципитации найдены гомологи и для архебактерий. Рассмотрим подробнее ситуацию с нейроспецифическими РНК. К примерам открытия редких нмРНК несистематическим подходом можно отнести достаточно случайное открытие нейросиецифичсской ВО РНК из тканей мозга мыши, которая была обнаружена Сатклиффом в г. Нозерну при использовании зонда, комплементарного короткому повторяющемуся элементу грызунов, т. Iэлементу Iii . Для дальнейшего тотального скрининга нмРНК из тканей мозга был использован метод, разработанный в Мюнстерском университете. Он был назван скриниш ом и заключается в следующем. Фракция суммарной, не только цитоплазматической, РНК была клонирована, но не как обычно, праймированием 3полиА последовательности мРНК, а методом достраивания на 3 конце полиС последовательности с последующим синтезом кДНК используя олиго праймер. Малые РНК разделялись на 2 фракции 0 нуклеотидов и нуклеотидов длиной. С помощью гибридизации на фильтрах скринировались клоны, которые соответствовали фрагментам тРНК, рРНК и другим известным нмРНК, что увеличивало частоту встречаемости новых нмРНК от в исходной библиотеки до в обогащенной. Было секвенировано, в целом, около 5 тыс. РНК. Немногим более половины новых РНК оказались новыми мядРНК молекул типа С и типа НАСА. Некоторые из них оказались орфонами, которые не имели очевидных партнеров среди рРНК или мяРНК. Другие обладали нсйроспецифичной экспрессией, которую исходно нельзя было предположить для молекул, вовлеченных в модификацию рРНК. Рис. Схема условной классификации направлений исследования генома. Выделено направление, получившее название экспериментальная рибономика, ко торое разрабатываюсь в настоящей работе. ПрадераВилли. Из РИК, которые были непохожи на мядРНК, для нельзя было предположить никакой функции. Поскольку для идентификации функций таких РНК эукариоты не являются идеальным объектом, то был предпринят поиск более удобного объекта с помощью компьютерного скрининга секвенированных геномов архебактерий, которые также обладают аналогами мядР К, хотя и не имеют ядрышка. Кроме того, было известно, что согласно данным иммунопреципитации, у них существуют аналоги мядРНК СОтиПа. Более того, архебактерии являются очень необычным царством, для которою могут быть характерны новые интересные функции аналогов эукариотических мядРНК, что может дать ключ к пониманию и новых функций мядРНК эукариот. Поэтому в данной работе была предпринята попытка тотального скрининга мнмРНК одного из представителей архебак ерий АгсгаеооЬмиз, принадлежащего подцарству ЕигуагсИаеоа. Действительно, удалось обнаружить наличие РНК СБтипа и, кроме того, впервые для архебактерий были экспериментально обнаружены П К НАСАтипа.