Изучение биохимических свойств белка Est3p, компонента теломеразного комплекса дрожжей Saccharomyces cerevisiae

• Автор: Шаранов, Юрий Сергеевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 121 с. : ил.

Содержание

Список сокращений

1. Введение

2. Обзор литературы. Компоненты и регуляция длины теломер почкующихся дрожжей vii.

2.1. Структура дрожжевых теломер.

2.1.1 Теломерная ДНК дрожжей

2.1.2. Субтеломерные области дрожжевых хромосом.

2.1.3. богатый одноцепочечный участок на 3конце.

2.2. Гены, влияющие на функции теломер

2.3. Белки, взаимодействующие с богатым одноцепочечным участком теломер

2.3.1. Белок

2.3.2. Теломеразный комплекс дрожжей vii.
2.3.2.1. Коровый фермент. и 2.
2.3.2.2. и 3 i viv регуляторные компоненты теломеразного комплекса.
2.3.3. Гетеродимер Ки.
2.3.4. X комплекс.
2.4. Белки, взаимодействующие с двухцепочечным участком теломер.
2.4.1. Белок и ассоциированные с ним факторы.
2.4.2. Гетеродимер Ки как компонент двухцепочечной области теломер
2.5. Регуляция структуры тсломерного конца
2.6. Регуляция длины теломер
2.6.1. Два состояния теломер
2.6.2. Теломеразное удлиннение богатого одноцепочечного участка прочно связано с полимеразным синтезом комплементарной цепи.
2.6.3. Удлиннение теломер в течение клеточного цикла
2.6.4. Ассоциация компонентов теломеразного комплекса с теломерным хроматином.
2.6.5. Контроль длины теломер с помощью рекомбинации
2.6.6. Контроль длины теломер с помощью киназы.
3. Результаты и обсуждение
3.1. Получение белка 3 с аффинным эпитопом
3.2. Взаимодействие 3 с рибо и дезоксирибоолигонуклеотидами
3.3. Способность 3 разворачивать дуплексы.
3.4. Влияние мутаций Е4А и 4 на свойства
3.5. Димеризация
3.5.1. Белок 3 с различными аффинными эпитопами и Сконцах
3.5.2. Образование гомодимера 3 i vi.
3.6. СТРазная и АТРазная активности белка 3.
3.7. Заключение.
4. Материалы и методы.
4.1. Реактивы, биопрепараты, буферные растворы, олигодезоксирибонуклеотиды, штаммы
4.2. Клонирование.
4.2.1. Выделение плазмидной ДНК.
4.2.2. Определение концентрации ДНК в растворе
4.2.3. ПЦР
4.2.4. Разделение фрагментов ДНК в агарозном геле.
4.2.5. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля
4.2.6. Приготовление векторов и вставок.
4.2.7. Лигирование
4.2.8. Приготовление компетентных клеток . i
4.2.9. Трансформация компетентных клеток . i
4.2 Определение первичной структуры ДНК по Сэнгеру
4.3. Выделение белка
4.3.1. Получение конструкции X
4.3.2. Получение конструкций 3, 6i3 и i.
4.3.3. Получение конструкции v6i3.
4.3.4. Введение мутаций в ген, кодирующий белок 3.
4.3.5. Выделение и очистка рекомбинантного белка
4.3.6. Выделение и очистка рекомбинантных белков 6i3 и i
4.3.7. Выделение и очистка рекомбинантного белка 6i3.
4.3.8. Определение концентрации белка с помощью осаждения трихлоруксусной кислотой
4.3.9. Электрофоретическое разделение белков в ПАЛГДСН
4.3 Вестернблотгинг белков
4.4. Тесты на связывание 3 с олигонуклеотидами.
4.4.1. Введение радиоактивной метки на 5конец олигонуклеотида
4.4.2. Связывание белков с олигонуклеотидами
4.4.3. Электрофоретическое разделение дуплексов, олигонуклеотидов и их белковых комплексов в нсдснатурирующем ПЛАТ.
4.5. Тесты на способность 3 разворачивать дуплексы.
4.6. Тесты на взаимодействие 3 с АТР и .
4.6.1. Тесты на АТРазную и ОТРазную активность 3.
4.6.2. Образование комплексов 3 с АТР и с помощью фотосшивок
4.7. Тесты на образование димера 3
5. Выводы
Список литературы


Это открытие стало огромным вкладом в только развивавшуюся на то время гипотезу о существовании в эукариотических клетках некого особого теломерспецифического фермента, способного удлиннять концы хромосом, и вызвало огромный интерес со стороны остальных иследователей, направивших свои усилия на изучение теломер дрожжей. Основными целями работ этих исследователей в первую очередь стали клонирование дрожжевых теломер, позволявшее подробно изучать концевые участки дрожжевых хромосом , и поиск генов, ответсвенных за регуляцию длины этих самых участков ,. Более двадцати лет исследований во множестве лабораторий по всему миру на сегодняшний день серьезно расширили представления о структуре дрожжевых теломер и о факторах, регулирующих их длину. Структура дрожжевых теломер. Теломерная ДНК дрожжей. Теломерная ДНК эукариотических организмов, как правило, состоит из тапдсмных повторяющихся нуклеотидных последовательностей длиной в среднем от пяти до восьми пар оснований. В большинстве организмов теломерные повторы строго регулярны и имеют четко определенную последовательность нуклеотидов в своем сотаве, например, для млекопитающих ,, для многих растений , для i . Теломеры дрожжей vii отличаются в этом плане, характеризуясь гетерогенными нерегулярными повторами, последовательность которых сокращенно можно записать как или i, если более точно , . Это отличие, по всей видимости, обусловлено неточным копированимем матричного участка дрожжевой тсломеразной РНК 1 . Гетерогенность теломерных повторов vii возникает, скорее всего, изза того, что синтез ДНК на концах хромосом может идти с различных участков этой ти нуклеотидной матричной последовательности 3АСАСАСАСССАСАССАС5 и, возможно, в некоторых местах иногда способен прерываться . На неоднородность теломерных повторов могут также влиять и некоторые другие процессы, такие как, например, нуклеотидная деградация или неполная полуконсервативная репликация двухцепочечной области теломерной ДНК. Гетерогенные теломерные повторы являются особенностью не только теломер vii, они свойственны также большинству других дрожжей рода , а, кроме того, многим систематически более отдаленным дрожжам, таким как v i и i i , и даже стоящим эволюционно выше почкующимся дрожжам, таким как i . Также нужно отметить, что иногда дрожжевые теломеры могут состоять из необычно больших повтров, длина которых может доходить до пар оснований . Если сравнить между собой матричные участки теломеразных РНК из различных дрожжей, обладающих гетерогенными теломерными повторами, то можно увидеть, что, не смотря на то, что они иногда сильно отличаются по длине и нуклеотидному составу, все же все они имеют некую сильно похожую коровую последовательность, содержащую в своем составе несколько консервативных нуклеотидов рис. Блэкберн с коллегами считают, что она является матрицей для синтеза участков, необходимых для взаимодействия с белком , связывающимся с двухцепочечной теломерной областью . Также существуют мнения, что теломерные повторы, синтезированные с этой коровой последовательности, могут быть важны для взаимодействия с некоторыми другими теломерсвязывающими белками, которые еще будут обсуждаться в дальнейшем, например с белком 3 . Рисунок 1. Сравнение матричных областей теломеразных РНК из различных дрожжей родов и v. Матричные последовательности выделены жирными заглавными буквами. Серым фоном выделены консервативные нуклеотиды коровой последовательности, частично комплементарной последовательности необходимой для связывания с белком . Гетерогенность дрожжевых теломерных повторов оказалась свойством, которое удалось использовать экспериментально и с его помощью продемонстрировать, что концы дрожжевых хромосом имеют очень динамическую структуру ,. В процессе детального анализа нуклеотидных последовательностей дрожжевых теломер было обнаружено, что центральная область ДНК у теломеры обычно имеет постоянный состав, а вот последние 0 нуклеотидов на самом конце хромосом характеризуются большой вариабельностью, проявляющейся по истечение одного или нескольких клеточных циклов.