CG-узнающие C5-цитозин-ДНК-метилтрансферазы SssI (Spiroplasma) и Dnmt3a (мыши): ингибирование и исследование особенностей каталитического механизма

• Автор: Черепанова, Наталья Александровна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 114 с. : ил.

Введение.

Глава 1. Ингибирование С5цитозинДНКметилтрансфераз Обзор литературы.

1.1. Классификация ингибиторов С5М Газ.

1.2. Нуклеозидные аналоги 2дезоксицитидинамншени механизмзависимыс ингибиторы.

1.2.1. Необратимые ингибиторы

1.2.2. Обратимые ингибиторы

1.3. Применение механизмзависимых ингибиторов в эпигенетической противоопухолевой терапии.
1.4. Использование механизмзависимых ингибиторов для изучения структуры и механизма действия С5МТаз

1.4.1. Рентгеноструктурный анализ РСА

1.4.2. Взаимодействие с мутантными формами С5МТаз.

1.5. Ненуклеозидные ингибиторы.

Глава 2. Свузнающие С5цитозинДНКмегилтрансферазы Бэб Бргоразш и ОшшЗа мыши ингибирование и исследование особенностей каталитического механизма Обсуждение результатов
2.1.Данные о ферментах.
2.2. Выделение ферментов.
2.3. Используемые олигонуклеотиды
2.4. Ингибирование СОузнающих ДНКметилтрансфераз8 и ЭгнтЗаСП
2.4.1 Димерные бисбензимидизолы как ингибиторы М.Ббя и ПшшЗаСО.
2.4.1.1. Действие димерных бисбензимидизолов на каталитическую активность М.Бк и 1ЭппНЗаСО.
2.4.1.2. Принцип ингибирующего действия ЭВп.
2.4.1.3. Взаимодействие ОВп с ДНКсубстратом
2.4.1.4. Взаимодействие 1ЭВп с ОппНЗаСО
2.4.1.5. Ингибирование метилирующем активности М. в клетках Е.соН. 2.4.2 Пиримидинонсодержащие ДНКдуплсксы как ингибиторы ОппнЗа
СО и М1.
2.4.2.1. Образование ковалентных интермедиатов реакции метилирования. .
2.4.2.2. Связывание ОппнЗаСО и М.ВаБ с Рсодсржащнми ДНКдуплексами.
2.4.2.3. Влияние ЭштЗЬ на образование ковалентного интермедиата реакции метилирования.
2.4.2.4. Молекулярные аспекты образования ковалентного интермедиата ОттЛЗаСЭ и М. с РДНК
2.4.2.5. Ингибирование М.8б и ОтшЗаСПОппЛЗЬ Рсодсржпщнмп ДНКдуплсксами
2.5. Исследование посгадиКного взаимодействия М.Эбз и ОппиЗаСБ с ДНК
2.5.1 Выпетливамие метилируемого цитозина из двойной спирали ДНК.
2.5.2. Взаимодействие каталитической петли ОппнЗаСГ с малой бороздкой ДИК при образовании ковалентного интермедиата
2.5.3. Исследование роли ряда аминокислотных остатков в М.Зй на различных стадиях реакции метилирования
2.5.3.1 Выбор аминокислотных остатков.
2.5.3.2. Аминокислотные остатки, участвующие в выпетливании метилируемого цитозина из двойной спирали ДНК.
2.5.3.3. Аминокислотные остатки, участвующие в катализе переноса мстилииоЙ группы на ДНК.
Глава 3. Экспериментальная часть.
3.1. Реактивы и материалы.
3.2. Приборы и методы.
3.3. Общие методики.
3.3.1. Формирование ДНКдуплексон
3.3.2. Плавление ДНКдуплексов.
3.3.3. Приготовление компетентных клеток.
3.3.4.Выделенис плазмид
3.3.5. Выделение 3 и .
3.3.6. Выделение . и ее мутантных форм
3.3.7. Определение Кi комплексов 3 с ДНК и с помощью метода поляризации флуоресценции
3.3.8. Определение А комплексов . с ДНК и с помощью метода торможения в 1еле.
3.3.9. Образование ковалентных интермедиатов С5МТаз с РДНК.
3.3 Определение ных ингибирующих концентраций но защите метилированной ДНК от рестрикции.
3.3 Определение ных ингибирующих концентраций по включению тритиовой метки
3.3 Исследование выпетлипания методом флуоресценции
3.3 Определение Кл комплексов с ДНК методом флуоресценции.
3.3 Ингибирование активности . бисбензимидазолами в клетках Е i
4. Выводы.
5. Литература.
Список сокращений
БСА бычий сывороточный альбумин ДТТ 1,4дитиотреитол
ИПТГ изопроп и лтиогал актоп н ранозид МТаза ДНКметилтрансфсраза оптическая единица ПААГполиакриламидный гель
С5МТаза ДНКмстилтрансфераза, метилирующая атом углерода С5 остатка цитозина
Синефунгин 9адснозильорнитин Трис трисгидроксиметиламинометан Тпд температура плавления ХС ксилснцианол
ОДТА этилсндиаминтстраацетат натрия РСА рентгеноструктурный анализ ЯМР ядерномагнитный резонанс 5аденозильметнонин аденозильгомоцистеин 5азацитозин В 2аминопурлн
ВДНК ДНК. содержащая 2аминопурин
ВРВ бромфеноловый синий
димерный бисбснзимидазол
3 каталитический домен
4 1р2дезокси0рибофуранозилпиримидин2 он
5,6дигидро5аза2дезоксицитидин
БОСХ эпигаллокатехинЗгаллат Рс1Су3 5фтор2дезокснцитидин КС 5фторцнтозин,
КЛМ карбоксифлуоресцеин
т5С 5метилцитозин
т5Ю М 5метил2дезоксицитидин
М эти л мал еим ид
Р пирнмидин2 1 7он
РДНКДНК, содержащая пиримидинон Р поляризация флуоресценции 4с1Сус1 4тио2дезоксицитидин додеци л сульфат натрия ХАСуд 5аза2дсзоксицитидин 7Суй 5азацн 1 идин кы, каталитическая константа Кд константа диссоциации К, константа Михаэлиса
У0 начальная скорость реакции метилирования Уш ах максимальная скорость реакции метилирования УТ фермент дикого типа
Для обозначения нуклеотидных звеньев, олигонуклеотидов использовали символы, рекомендованные комиссией по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии ШРАС и Международного союза биохимиков ШВ.
Введение


В клетках животных и человека метилирование Свпослсдовательностсй в ДНК осуществляется С5цитозннДНКметилтрансфсразами С5МТазами ЭлтИ, ОптОа и ЭппИЗЬ 2. С5МТазы катализируют перенос метильнои группы от кофактора. Заденозильметионина , к аюму углерода С5 остатка цитозина. Л при этом превращается в Заденозилдгомоцистеин Л. Метилированные СОучастки расположены в ДНК определенным образом, формируя профиль метилирования, который создается похо С5МТазами ОппнЗл и ЭпппЗЬ в процессе эмбриогенеза и копируется после каждого раунда репликации 1. При некоторых заболеваниях, в частности при наличии опухолей, наблюдается изменение профиля метилирования. Тотальное гипометилнрованис повторяющихся фрагментов ДНК в опухолевых клетках вызывает нестабильность генома 3. Наряду с этим в первичных опухолях и в опухолевых клеточных линиях происходит гипсрмстилированис за счет метилирования СОостровкоп в промоторных областях определенных генов, в том числе геновсупрессоров опухолевого роста, что приводит к их инактивации в процессе канцерогенеза . В настоящее время не вызывает сомнений, что С5МТаза ЭштйЗа играет важную роль в различных типах клеток. Выявлена роль функционирования ЭпнйЗа при развитии таких онкологических заболеваний, как меланома и рак толстого кишечника , . В отличие от необратимых изменений в геноме, характерных для опухолевых клеток, гипсрмстилированис промоторных областей генов как эпигенетический процесс потенциально обратимо. Это делает метилирование ДНК привлекательной мишенью для терапевтического вмешательства. Можно изменять статус метилирования ДНК и клетке путем воздействия на функционирование С5МТаз с помощью ингибиторов этих ферментов. Следует отмстить, что данные об ингибировании эукариотических С5МТаз ограничены и относятся, главным образом, к ПпшЦ. Вопрос об ингибировании важнейшей эукариотической С5МТазы ПппЦЗа ранее практически не изучался. Кроме того, механизм ее взаимодействия с ДНК до сих пор остается малоизученным. Объектами исследования в настоящей работе стали каталитический домен РппиЗа мыши ОппиЗаСО и прокариотическая МТаза 8чч1 М. Бчч, которая, как и эукариотические ферменты, узнает в ДНК короткую ССпоследовательность и поэтому является привлекательной моделью для изучения эукариотических С5МТаз. Целью работы было исследование ингибирования ОпппЗа мыши и М. Хр1гор1а8пш. В работе решались следующие задачи 1 Исследование ингибирования М. Ячч и ОппИЗаСЭ с помощью соединений ненуклеозидной природы димерных бисбснзимидазолов, и механизмзависимых ингибиторов ДНК, содержащих остаток пиримидинона. Исследование постадийного взаимодействия М. ОшшЗаСй с ДНК, изучение роли регуляторного фактора ОппИЗЬ в каталитическом механизме ОппНЗа и определение роли некоторых аминокислотных остатков на различных стадиях реакции метилирования, проводимой М. Бчз. Глава 1. Известные сегодня ингибиторы С5МТаз можно разделить на несколько групп. Первая группа продукты реакции метилированная ДИК и . Вторая руша аналоги кофактора , способные связываться с ферментом, но не являющиеся донорами метильной группы. Из ингибиторов этого типа наиболее широко используется синефунпш 5аденозильорнитин, по структуре максимально близкий к рис. К этой же группе следует отнести такие соединения, как 5метилтно5дезоксиаденозин, 5,амино5,дезоксиадеозин, карбоксиэтилтио5дезоксиаденозин 2 и др. Третья группа ингибиторы нуклеозидноп природы, аналоги 2дезоксицнтпдина рис. В эту группу входят 5азацитидин , вндаза , 5аза2дезоксицнтндин , децитабин , 5,6дигидро5аза2дсзоксицитиднн , , 5фтор2дсзоксицитндин . Уон 4, зебуларин н 4тно2дезоксицитндин 4 . Это механизмзависпмыс i ингибиторы. Для проявления ингибирующей активности они должны быть специфически включены в состав ДНК Четвертая группа специфические одноцспочечиыс олигонуклеотиды и ДНКдунлексы аналоги природных субстратов С5МТаз, обладающие ббльшим сродством к С5МТазам, чем природные субстраты . Пяая группа различные низкомолекулярные соединения ненуклеозидной природы рис 1, в пищевые полнфенолы, выделенные из зеленого чая. Згаллат и бобов сон бисульфидиые производные бромгирозииа псаммаилнны 1 производное трштофана .