Изучение взаимодействия фермента репарации формамидопиримидин-ДНК гликозилазы E. coli с фосфатными группами ДНК

• Автор: Рогачева, Мария Владимировна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 188 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ФЕРМЕНТЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ В РЕПАРАЦИИ

8ОКСОГУАНИН А ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Системы репарации 8оксогуанина в клетках про и эукариот.

1.2.8ОксогуанннДНК гликозилазы

1.2.1. 8ОксогуапинДНК гликозилазы прокариот

1.2.1.1. Структура прокариот.

1.2.1.2. Субстратная специфичность Рр прокариот

1.2.1.3. Каталитический механизм прокариот.

1.2.1.4. Конформационные перестройки комплексов прокариот с ДНК

1.2.1.5. Взаимодействие прокариот с остатком охо поврежденной ДК

1.2.1.6. Взаимодействие прокариот с цепью ДНК, комплементарной поврежденной.
1.2.1.7. Поиск охо в структуре ДНК прокариотическими ферментами
1.2.2. 8ОксогуанинДНК гликозилазы эукариот
1.2.2.1. Структура Л.
1.2.2.2. Субстратная специфичность эукариот
1.2.2.3. Каталитический механизм эукариот.
1.2.2.4. Конформационные перестройки в комплексе 1гохоСДНК.
1.2.2.5. Поиск в геноме остатков охо ферментом .
1.3. АденинДНК гликозилазы.
1.3.1. АденинДНК гликозилазы прокариот.
1.3.1.1. Структура МиУ прокариот
1.3.1.2. Субстратная специфичность МиУ прокариот.
1.3.1.3. Каталитический механизм МиУ прокариот.
1.3.1.4. Конформационные перестройки в комплексах Ми У прокариот с охоСАсодержащей ДНК
1.3.1.5. Взаимодействие МиУ прокариот с остатком охоС ДНКсубстрата
1.3.2. АденинДНК гликозилазы эукариот
1.4.8Оксогуаноз1Штрифосфатаз ы
1.4.1.8Оксогуанозинтрифосфатазы прокариот
1.4.1.1. Структура . i.
1.4.1.2. Субстратная специфичность . i.
1.4.1.3. Каталитический механизм . i.
1.4.2. 8Оксогуанозинтрифосфатазы эукариот.
1.4.2.1. Структура 8оксогуанозинтрифосфатаз эукариот.
1.4.2.2. Субстратная специфичность 8оксогуанозинтрифосфатаз эукариот ГЛАВА 2. ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТА РЕПАРАЦИИ ФОРМАМИДОПИРИМИДИНДНК ГЛИКОЗИЛАЗЫ . I ФОСФАТНЫМИ ГРУППАМИ ДНК ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
2.1. Экспрессия и выделение формамидониримицинДНК гликозилазы . i
2.2. Дизайн и синтез модифицированных ДНКдуплсксов, содержащих пирофосфатные и замещенные пирофосфа гные межнуклеотидные группы .
2.3. Исследование структу ры модифицированных ДНКдуплексов комбинированным методом квантовой и молекулярной механики
2.3.1. Выбор модельной системы
2.3.2. Оптимизация геометрических параметров
2.3.3. Сравнение теоретических и экспериментальных данных для структуры модифицированного ДНКдуплекса
2.3.4. Влияние пирофосфатной и реакционноспособной Оэтилзамещенной пирофосфатной групп на структуру ДНКдуплексов.
2.3.5. Электронное строение пирофосфатной и Оэтилзамещенной
пирофосфатной групп в составе ДНК
2.4. Специфическое связывание модифицированных ДНКдуплсксов с
формамидопиримидинДНК гликозилазой . i.
2.4.1. Определение констант диссоциации комплексов модифицированных аналогов субстратов с ферментом
2.4.2. Доказательство специфичности связывая .
2.5. Каталитическое расщепление модифицированных ДНКдуплексов
формамидопиримидинДНК гликозилазой . i
2.5.1. Определение кинетических констант каталитического расщепления модифицированных аналогов субстратов ферментом.
2.5.2. Изучение взаимодействия ДНКдуплексов, содержащих модифицированные межнуклеотидные группы, с 8оксогуанинДНК гликозилазой человека
2,5.3. Изучение механизма взаимодействия ферментов . i и I с ДНКдуплексами, содержащими модифицированные межнуклеотидные группы в 5 и 5положениях остатка 8оксогуанозина.
2.6. Региоспецифическое ковалентное связывание . i с ДНКдуплексами, содержащими 0этилзамсщенные пирофосфатныс межнуклеотидные
группы.
2.7. Взаимодействие ДНКдуплексов, содержащих замещенную пирофосфатную межнуклеотидпую группу, с мутаптными формами . i
2.8. Определение аминокислоты . i, ковалентно связанной с фосфатной группой ДНК в положении, каталитически расщепляемом фермен том
2.9. Схема взаимодействия . i с фосфатными группами xсодержащей ДИК в составе специфическою ферментсубстратного комплекса в растворе.
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
3.1. Реактивы и материалы.
3.1.1. Реактивы.
3.1.2. Среды для культивирования клеток.
3.1.3. Буферные растворы
3.1.4. Олигодезоксирибонуклеотиды.
3.1.4.1. Модифицированные олигодезоксирибонуклеотиды.
3.1.4.2. Анализ синтезированных олигонуклеотидов.
3.1.5. Ферменты.
3.2. Методы.
3.2.1.Электрофорез в полиакриамидиом геле в денатурирующих условиях
3.2.2. Электрофорез в полиакриамидиом геле в неденатурирующих условиях
3.2.3. Электрофорез в полиакриламидном геле.
3.2.4. Радиоавтография
3.3. Общие методики.
3.3.1. Экспрессия .i и
3.3.2. Выделение . i .
3.3.3. Выделение
3.3.4. 5РФосфорилирование олигонуклеотидов.
3.3.5. Синтез этиловых эфиров олигонуклеотидов
3.3.6. Синтез модифицированных ДНКдуплексов методом химического
лигирования.
3.3.7. Получение модифицированного ДНКдуплекса, содержащего АРучасток.
3.3.8. Аминолиз и гидролиз ДНКдуплексов, содержащих модифицированные межнуклеотидные группы.
3.3.9. Специфическое связывание модифицированных ДНКдуплексов с
. i, и мутантными формами . i
3.3 Каталитическое расщепление модифицированных ДНКдуплексов
. i и .
3.3 Расщепление межнуклеотидной фосфодиэфирной связи в ДНКдуплексах, содержащих АРучастки.
3.3 Ковалентное связывание реакционноспособных аналогов субстратов с
. i.
3.3 Протеопиз ковалентного комплекса ДНКдуплекса IV с . i
3.3 Выделение олигонуклеотидопептидного конъюгата и расщепление ковалентной связи между олигонуклеотиднът и пептидным фрагментами конъюгата.
3.3 Массспектрометрия.
3.3 Компьютерное моделирование.
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Поврежденное основание охов, возникающее в ДНК в результате окислительного стресса или под воздействием ионизирующей радиации, удаляется прокариотическим ферментом , а последующие репарационные процессы восстанавливают исходную вС пару. В том случае, когда по какимлибо причинам основание охов не было удалено до процесса репликации, образуются ДНК, содержащие как охоОС пары, так и охоОА пары. Прокариотический фермент Ми1У удаляет ошибочно встроенный аденин, затем ДНКполимераза I встраивает сСМР напротив охосЮ, а ДНКлигаза восстанавливает непрерывную цепь ДНК. В результате образуется ДНК, содержащая оховЮ пару, являющаяся субстратом Ир прокариот. Действие реакционноспособпых частиц кислорода может приводить к возникновению охосЮТР. В этом случае прокариотический фермент МШТ гидролизует охосЮТР до охосЮМР, удаляя поврежденный трифосфат из смеси мононуклеозидтрифосфатов клетки. Однако возможно ошибочное встраивание остатков охов напротив аденина ДНКматрицы. В таком случае прокариотический фермент МЩУ оказывается вовлечен в процесс мутагенеза, поскольку удаление аденина из неканонической охоОА пары приводит к трансверсии АТ пары в С0. Кроме того, охов может быть встроен напротив цитозина в процессе репликации, что приводит к образованию ДНК, содержащей охоО. С пары. ЮОсистема эукариот построена аналогичным образом. На рисунке 2 в качестве примера представлена схема функционирования ферментов такой системы в клетках человека , , , , . ОксогуанинДНК гликозилаза человека типа 1 ЪО1 узнает и удаляет остатки охов, образующего комплементарную пару с цитозином. ОксогуанинДНК гликозилаза человека типа 2 Ю2 репарирует остатки охоО, формирующего пары с пуриновыми основаниями. АденинДНК гликозилаза или 8оксогуанинмисматч гликозилаза человека ЬМУН удаляет остаток аденина, ошибочно встроенный в процессе репликации напротив охов. Фермент репарации ЬМТН гидролизует окисленные нуклеозидгрифосфаты пуринового ряда, включая охосЮТР, эффективно удаляя их из нуклеотидной смеси и предотвращая их внедрение в ДНК. Репликация . Рис. ОксогуанинДНК гликозилазы являются бифункциональными гликозилазамиАРлиазами, катализирующими удаление остатков x и последующее расщепление углеводофосфатного остова ДНК, содержащего апуринапиримидиновые АР участки. Эти ферменты являются мономерными глобулярными белками с молекулярной массой кДа и изоэлектрической точкой 8. ОксогуанинДНК гликозилазы прокариот имеют высокую степень консервативности, общие мотивы третичной структуры, сходную субстратную специфичность и механизм каталитического действия. Первым выделенным, охарактеризованным и наиболее изученным ферментом данного класса является формамидопиримидинДНК гликозилаза . Первоначально этот фермент был описан как гликозилаза, специфичная к остаткам 2,6диамино4гидрокси5Мметилформамидопиримидина 7, которые возникают в ДНК при метилировании 7 атома гуанина с последующим раскрытием гетероцикла под влиянием различных окислителей , . Эго повреждение блокирует синтез ДНК и, таким образом, потенциально летально i viv . В настоящее время известно, что формамидопиримидинДНК гликозилазная и 8оксогуанинДНК гликозилазная активности, присутствующие в клетках . Гены , кодирующие белки . До недавнего времени информация о трехмерной структуре прокариот отсутствовала, что было связано с трудностями в кристаллизации этих ферментов. В году впервые была решена третичная структура Т. Позднее удалось закристаллизовать комплексы ферментов i , , В. ДНК, содержащими участки, а также комплекс каталитически неактивного В. ДНК . В результате этих структурных исследований была получена ценная информация об общей архитектуре прокариот и их комплексов с ДНК. Оказалось, что ферменты из различных прокариотических источников имеют сходную третичную структуру и принадлежат к одному семейству, в состав которого, кроме этих ферментов, входят эндонуклеаза VIII . ОксогуанинДНК гликозилазы прокариот содержат два основных домена, соединенных гибкой полипептидной петлей рис. Рис. Структура ковалентного комплекса . ДНК, содержащей АРучасток . V и Сконцевые домены красным, Сконцевой домен синим, мотив Н2ТН фиолетовым, мотив цинкового пальца голубым, атом цинка серым.