Сравнение каталитических механизмов растворимых пирофосфатаз двух семейств

• Автор: Зырянов, Антон Борисович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 146 с. : ил

В ряде случаев мутации аминокислотных остатков активного центра приводили не только к существенному падению каталитической активности, но и к нарушению пространственной и олигомерной структуры ферментов. Это указывает на то, что протяженная сеть нековалентных взаимодействий внутри активною центра существенна ыя пространственной структуры белка. Кроме кинетики гидролиза РР, влияние мутаций оценивалось по следующим свойствам ЕРРазы 9 и РРазы , поверхностной гидрофобиости , олигомерной структуре , , и термостабильности , . Изменения в поверхностной гидрофобиости оценивали по изменению связывания флуоресцентного красителя нильского красного. РРазы семейства 1 имеют незначительную поверхностную гидрофобноегь, и существенное увеличение сс при заменах, как и существенное уменьшение термостабильности, свидетельствует о нарушении пространственной структуры . Изменения в олигомерной структуре оценивали по изменению электрофоретической подвижности вариантов по сравнению с РРазами ,. Большинство вариантов ЕРРазы и РРазы с замененными аминокислотными остатками активного центра менее активны по сравнению с РРазами природных штаммов, для ряда вариантов изменяется и трехмерная структура. При неконсервативных мутациях аминокислотных остатков активного центра V, V, е происходит, как правило, полная потеря активности. Гак, полностью неактивны варианты ЕРРазы 2V и К сильное увеличение их поверхностной гидрофобности указывает на разрушение структуры фермента . Варианты ЕРРазы , . V, . V, 4. К пониженную термостабильность, , , 4 нарушенную олигомерную структуру, хотя и обладают каталитической активностью. Варианты V, , I, I имеют активность, незначительно отличающуюся от активности РРазы, на основании чего предполагается, что , Туг, 1 и 8 не играют существенной роли в активности ЕРРазы . Двенадцать аминокислотных остатков , , , , , 2, , , , , и существенны для каталитической активности, что доказывается сильным снижением активности при их консервативных заменах, однако в случае последних пяти остатков консервативные мутации вызывают изменения в структуре фермента, что затрудняет оценку важности этих остатков для активности ЕРРазы . При изучении свойств девятнадцати вариантов РРазы с консервативными заменами в активном центре были обнаружены сходные эффекты замен. Однако, замены в РРазе сильнее влияют на активность, чем в ЕРРазе. В РРазе мутации по четырм аминокислотным остаткам , . ЕРРазе полная потеря активности наблюдается только при консервативной замене гомологичного 0 в РРазе. Кроме того, ни один из девятнадцати вариантов РРазы 1 не обнаруживает изменений в олигомерной структуре, хотя межсубъединичные контакты в четырх из них , , , 4 были ослаблены. Это объясняется различием межсубъединичных контактов в ЕРРазе и УРРазе. Варианты , , , 8, 0 и 8 показывают падение активности менее чем в три раза по сравнению с вероятно, остатки , , Туг, , , менее важны для каталитической активности РРазы. Варианты , 7Е, 0, 2 вообще не имеют каталитической активности следовательно, , 7, и наиболее важны для активности РРазы. Остатки активного центра , и ЕРРазы и гомологичные им ii, и РРазы, мутации которых не влияют существенно на активность ферментов, консервативны в первичной структуре, но не сохраняются в третичной i РРазы и ЕРРазы 6, , , . Остатки, мутации которых вызывают существенную потерю активности, сохраняются как в первичной, так и в пространственной сгруктурс обоих ферментов. Эффекты некоторых мутаций, легко интерпретировать с использованием данных А. Так, Туг является важной частью ждрофобного кора ЕРРазы. Его гидрофобная боковая цепь находится в контакте с боковыми цепями Туг и , которые, в свою очередь, образуют контакты с боковыми цепями остатков спирали а5 9. Туг образует также водородные связи с Туг и . Это объясняет, почему в варианте ЕРРазы изменены гидрофобноегь и олигомерная структура . Вариант 4 имеет изменения во всех структурных свойствах поверхностной гидрофобности, олигомерной структуре, термостабильности. В РРазе мутация но Гуг, соответствующему Туг в РРазе, не оказывает влияния на олигомерную структуру.