Разработка физико-химических подходов к разделению и идентификации пептидных продуктов с антибактериальными свойствами

• Автор: Федоткина (Срибная), Олеся Сергеевна
• Шифр специальности: 02.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 199 с. : ил.

Оглавление
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ФИЗИКОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ПРИ ВЫДЕЛЕНИИ И ОПРЕДЕЛЕНИИ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ.
1.1. ФИЗИКОХИМИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ РАЗДЕЛЕНИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ
1.1.1. Гельпроникающая колоночная хроматография и твердофазная экстракция как начальные этапы очистки пептидовЛ
1.1.2. Применение ВЭЖХ для установления физикохимических характеристик удерживания пептидов и условий их определения на силикагеле С и пористом графитированном углероде Гиперкарб.

1.1.3. ВЭЖХ исследование пептидов на катионообменных носителях

1.1.4. Физикохимические основы хроматографической идентификации пептидов

1.1.5. Физикохимические характеристики удерживания и их корреляции со

свойствами исследуемых молекул

1.2. ФИЗИКОХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МАСССПЕКТРОМЕТРИИ ПЕПТИДОВ

1.2.1. Основные используемые в массспектрометрии пептидов методы ионизации и типы массанализаторов
1.2.2. Пробоподготовка и ионизация пептидов в методе МАЛДИ
1.2.3. Особенности фрагментации пептидов в условиях получения МАЛДИМСМС спектров
1.2.4. Структурная информация, получаемая на основе МСМС спектров и ее использование для идентификации пептидов
1.2.5. Массспектр как физикохимическая характеристика пептида.
1.3. АНТИМИКРОБНЫЕ ПЕПТИДЫ СВОЙСТВА, ЗНАЧЕНИЕ И МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ
1.3.1. Значение и свойства антимикробных пептидов
1.3.2. Пептиды в насекомых.
1.3.3. Биологическое тестирование
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2.1. Реагенты и оборудование.
2.2. Объекты и пробоподготовка.
2.3. Методики проведения физикохимического эксперимента.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОБОПОДГОТОВКИ
3.2. АНТИМИКРОБНЫЙ ТЕСТ И ЕГО РЕЗУЛЬТАТЫ.
3.3. СРАВНЕНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ФИЗИКОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ХРОМАТОГРАФИРОВАНИЯ ПЕПТИДОВ И ВЫБОР ОПТИМАЛЬНЫХ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ УСЛОВИЙ.
3.3.1. Катионообменная гельхроматография пептидов гусеницы i на сефадексе СМ
3.3.2. Сравнительное исследование пептидных фракций гусеницы i методом обращеннофазовой ВЭЖХ
3.3.3. Катионообменное ВЭЖХ исследование пептидов i
3.3.4. ВЭЖХ исследование пептидов гусеницы i на сорбенте Гиперкарб и молекулярностатистическая оценка теплот адсорбции пептидов
3.3.5. Физикохимические характеристики удерживания, используемые для
построения корреляций со свойствами исследуемых пептидов.
3.4. СРАВНИТЕЛЬНОЕ МАСССПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПЕПТИДОВ
3.4.1. Изучение антибактериальных пептидных фракций после катионообменной гельхроматографии методом МАЛДИ
3.4.2. Изучение пептидного состава фракций после обращеннофазовой ВЭЖХ для разных пептидных смесей.
3.4.3. Изучение пептидного состава фракций после катионообменной ВЭЖХ для разных пептидных смесей.
3.4.4. Идентификация пептидов i по базам данных.
3.4.6. Гидролиз пептидов трипсином в антибактериальных фракциях и массспектрометрическое изучение проду ктов гидролиза
3.4.7. Применение алгоритмов секвенирования v для идентификации пептидов гусеницы i .
3.4.8. Физикохимическая характеристика пептидов на основе масс
спектрометрических данных. МСМС спектры
3.5. СОЧЕТАНИЕ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ И МАСС
СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
БЛАГОДАРНОСТИ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Согласно одним представлениям гидрофобные ионы ионпар юго агента сорбируются на поверхности октадецилсиликагеля таким образом, что к подвижной фазе обращены заряженные группы. Предполагается, что сорбция в таких системах подчиняется закономерностям ионообменной хроматографии. Согласно другим представлениям, поверхностное модифицирование сорбента не играет существенной роли. Предполагается, что гидрофобный противоион образует с хроматографируемым ионом пару в растворе подвижной фазы. Эта ионная пара затем сорбируется на неполярной поверхности по обращеннофазовому механизму. Вероятно, истинный механизм процесса сорбции зависит от типа используемого ионпарного агента и условий эксперимента. Количество ионпарного агента в неподвижной фазе зависит от его гидрофобности, концентрации в элюенте и от . При отсутствии органического модификатора в элюенте или неизменной его концентрации изотермы сорбции ионпарных модификаторов близки к ленгмюровским. Существуют данные, указывающие на конкуренцию органических и ионпарных модификаторов, которая происходит при градиентном элюировании. Величина и направление модифицирующего эффекта связаны с гидрофобностью и знаком заряда ионпарного агента. Если сорбат и модификатор имеют одинаковые заряды, то введение последнего уменьшает удерживание. При разноименных зарядах удерживание увеличивается . Свойства обращеннофазовых сорбентов одного типа изготовленных различными производителями не идентичны и зависят от многих причин. X 8, 8, x , 8, 8. Данные сорбенты используются с двумя размерами пор и 0 А. Фаза x i X это мезопористый сорбент А, специально разработанный для хроматографического разделения смесей соединений при средних значениях и имеющий хроматографически однородную и полностью гидрофобную поверхность, которая образуется благодаря эндкеппированию свободных ОН групп, не вступивших в реакцию прививки октадецильных групп, тримелилсилильными производными. Такая гидрофобная поверхность сорбента должна приводить к преобладанию дисперсионных взаимодействий при адсорбции пептидов. Селективность сорбента и порядок элюирования пептидов в процессе разделения должны резко отличаться от неэндкеппированных сорбентов и сорбентов, имеющих губчатую структуру зерна. Сорбенты x , С8, 8 не имеют эндкеппинга и разработаны для хроматографирования в сильнокислых средах до 0. Для ОФ хроматографии пептидов характерно использование кислых сред и ионпарных агентов. Так, в работах и пептиды разделяли на колонке x i X С, используя для уравновешивания колонки 0. Разделение и очистку пептидных молекул часто проводят, добавляя 0. X0 С. В работе при разделении на сорбенте x 0 С, особенно стойком при низких , была использована концентрация муравьиной кислоты 0. М фосфат аммония при разделении на колонке x i АААС. Использование 0. ТФУ как ионпарного реагента при ОФ ВЭЖХ анализе пептидов является классическим приемом это продемонстрировано в следующих работах на колонках x i X8 , , , x i X , x , x , , x 0 . Ряд работ описывает использование более низких 0. ТФУ 0. Примеры применения концентраций ТФУ 0. X8,, которые лучше всего работают в среднем диапазоне , , и для сорбента x 0 . В работе для анализа гидрофобности пептидов на колонке x X была применена концентрация ТФУ 0. В работе провели успешное разделение пептидов на колонке x i X8, используя 0. Представляет интерес изучение влияния физикохимических характеристик анионных ионпарных реагентов на анализ пептидов методом ОФ ВЭЖХ. Так, в работе проведено сравнение действия ТФУ, пентафторпропионовой кислоты и гептафтормасляной кислоты при хроматографии пептидов. Показано, что концентрация анионного ионпарного реагента и его гидрофобность значительно влияют на порядок элюирования и разделение пептидов. Хотя наиболее распространенный органический модификатор подвижной фазы в ОФ ВЭЖХ пептидов ацетонитрил все описанные выше работы выполнены с его использованием в работах и при разделении на колонке x i X пептиды элюировали смесью метанол ацетонигрил и э ганолом или изопропанолом, соответственно. Существуют также немногочисленные примеры хроматографирования пептидов на пористом графитированном углероде Гиперкарб .