Масс-спектрометрическое профилирование кожных секретов ранидных и хилидных лягушек

• Автор: Горшков, Владимир Александрович
• Шифр специальности: 02.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 167 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. РОЛЬ ПЕПТИДОВ В ЖИВЫХ ОРГАНИЗМАХ А

1.1.1. Коммуникативные пептиды.

1.1.2. Мембраноактивные пептиды

1.1.2.1. Строение мембраноактивных пептидов

1.1.2.2. Механизм действия мембраноактивных пептидов

1.1.2.3. Ингибиторы синтеза

1.2. Пептиды из кожных секретов амфибий семейства А1шка

1.2.1. Синтез пептидов в организме амфибий

1.2.2. Амфибии рода Капа и Ну1а.

1.2.3. Кожные пептиды раиидных лягушек
1.2.3.1. Мембраноактивные пептиды.
1.2.3.1.1. Активность дисульфидсодержащих пептидов.
1.2.3.1.2. Пептиды, несодержащие дисульфидной связи.
1.2.3.2. Нейропептиды ранидных лягушек
1.2.3.2.1. Тахикинины
1.2.3.2.2. Ранатензины и бо.мбезины
1.2.3.2.3. Брадикинины.
1.2.4. Пептиды хштидных лягушек.
1.2.4.1. Мембраноактивные пептиды.
1.2.4.1.1. Семейство дсрмасептина
1.2.4.1.2. Пептидыаитибиотики австралийских квакш.
1.2.4.2. Пейропептиды.
1.2.4.2.1. Касрулины.
1.2.4.2.2. Опиоидные пептиды.
1.2.4.2.3. Трнптофнллипы.
1.3. Секвенирование пептидов
1.3.1. Химические методы
1.3.1.1. Метод Эдмана.
1.3.1.2. Леддернос секвенирование.
1.3.2. Методы генной инженерии
1.3.3. Массспектрометрическое секвенирование пептидов и белков.
1.3.3.1. Применяемые для секвенирования пептидов методы ионизации.
1.3.3.1.1. Ионизация элсктрораспылснисм ЭР.
1.3.3.1.2. Матричноактивированная лазерная десорбцияионизация МАЛДИ
1.3.3.2. Тандемная массспсктрометрия.
.1. Диссоциация, активированная соударениями ДЛС.
1.3.3.2.2. Диссоциация при захвате ДЭЗ или переносе электрона ДПЭ
1.3.3.2.3. Фрагментация в МАЛДИ
1.3.3.3. Компяементарность различных способов активации фрагментации полипептидных цепей.
1.3.3.4. Сложности массспектромстрического секвснирования
1.3.3.4.1. Изомерные и изобарные аминокислоты
1.3.3.4.2. Внутримолекулярная днеульфидная связь.
1.3.3.4.3. Массснектро.мстрическне методы разрушения связей.
1.3.3.4.4. Газофазная циклизация Ь и яионов коротких пептидов
1.3.3.5. Модификация концевой аминогруппы.
1.3.3.5.1. Введение незаряженной группы на конец пептида.
1.3.3.5.2. Введение отрицательно заряженной группы на конец пептида
1.3.3.5.3. Введение положительно заряженной группы на конец пептида
2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
2.1. Оптимизация процедуры получения кожных секретов
2.2. Оптимизация ВЭЖХ разделения кожных секретов
2.3. Детальное массспектрометрическое профилирование кожных секретов ранидных И ХИЛИДИЫХ ЛЯГУШЕК
2.3.1. Комплементарность результатов v секвснирования полученных в режимах ДЛС и ДЭЗ
2.3.2. Ранидные лягушки.
2.3.2.1. Комплементарность процедур карбоксамидометилирования и окисления дисульфидных связей ранидных пептидов.
2.3.2.2. Побочные реакции, зафиксированные при карбоксамидомстилировании и окислении дисульфидных связей.
2.3.2.3. Кожный пептидом озерной лягушки, ii
2.3.2.4. Кожный пептидом прудовой лягушки,
2.3.2.5. Кожный пептидом съедобной лягушки,
2.3.2.6. Кожный пептидом травяной лягушки, i
.2.1. Кожный пептидом остромордой лягушки, vi
2.3.3. Хилидные лягушки
2.3.3.1. Газофазная циклизация Ь и яионов коротких пептидов
2.3.3.2. Изучение трех способов предотвращения циклизации ионов коротких пептидов.
2.3.3.3. Кожный пептидом квакши обыкновенной,
2.4. Экспресспрофилирование кожных секретов ранидных лягушек
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Вместе с тем существует некоторое количество микроорганизмов, невосприимчивых к пептидным антибиотикам. Так, например, мембрана бактерий родов и i содержит слишком мало анионных липидов, что снижает притяжение пептидов к ней, а бактерия рода iivi выделяет протеазы, дезактивирующие пептиды . Однако и в этом случае не происходит развития приобретенных механизмов устойчивости. Некоторые виды грамотрицательных бактерийспособны изменять состав внешней мембраны, вводя в нее положительно заряженные молекулы этаноламина и 4аминоарабинозы , , нейтрализующие отрицательный заряд мембраны и снижающие тем самым активность антимикробных пептидов. Этот процесс запускается регулоном . Таким образом, изначально нерезистентный вид может пробрести устойчивость к пептидным антибиотикам. Для многих пептидов свойственно выполнение нескольких функций одновременно. Так, например, антимикробные дефенсины и кателицидины могут выступать как хемокины, привлекая к i заражения Тлимфоциты и нейтрофилы , . Показано также, что некоторые нейропептиды способны проявлять антимикробную активность . Молекула 0 является одним из самых распространенных меж и внутриклеточных передатчиков сигнала, задействованным во множестве ключевых биологических процессов . Практически каждый тип клеток, известных к настоящему времени, способен производить с помощью хотя бы одной из форм синтаз. Выделяют нейрональную, индуцибельную и эндотелиальную синтазы. Нейрональная 0синтаза находится в нервных клетках и некоторых скелетных мышцах. Она отвечает за передачу нервного импульса . Индуцибельная синтаза локализована в клетках иммунной и сердечнососудистой системы ее функцией является обеспечение защиты от патогенов , . Эндотелиальная синтаза расположена в эндотелии сосудов и. Учитывая все многообразие функций 0 в клетках, можно быть уверенным, что ингибирование синтеза 0 существенным образом повлияет на жизнедеятельность организма , . Такой тип активности в отношении нейрональной ТЮсинтазы был обнаружен для некоторых пептидов амфибий . Все типы ГЮсинтаз имеют в общих чертах похожее строение. Они состоят из окислительного и восстановительного доменов, а также домена связывания Са2кальмодулина, который обеспечивает взаимодействие между этими двумя доменами . Пептидные ингибиторы нарушают коммуникацию между Са2кальмодулином и 0синтазой. Это подтверждается тем, что активность ингибированного фермента частично восстанавливается при добавлении Са2кальмодулина , . Комплекс, образующийся между пептидом и Са2кальмодулином, может быть зарегистрирован с помощью двумерного ЯМР и массспектрометрии . При связывании с пептидом Са2кальмодулин меняет свою форму, и в следствие этого ухудшается взаимодействие с соответствующим доменом ИОсинтазы , . Са2кальмодулин участвует также в регулировании кальциневрина киназы, фосфорилируюгцсй белки и аденилатциклазу функционировании цитоскелета эукариот и движении ресничек некоторых простейших . Известно, что бактериальные 0синтазы задействованы в противостоянии антибиотикам, окислительному стрессу и атакам иммунной системы организмахозяина , . Таким образом, можно заключить, что пептидные ингибиторы ЫОсинтазы призваны нанести максимальный вред потенциальному хищнику или паразиту, хотя, возможно, их цель регуляция функций организма амфибии. Данный вопрос не до конца ясен и требует дальнейшего исследования. Бесхвостые амфибии представляют собой группу обычно некрупных, сравнительно медленно передвигающихся и мягкокожих животных, что делает их удобной добычей для хищников из числа рыб, пресмыкающихся, млекопитающих и птиц. Их тела лишены защитных покровов панцирей, клыков, когтей и т. Однако в их распоряжении имеется высокосложный химический защитный арсенал, выделяемый спинными кожными железами в стрессовых ситуациях и моменты агрессии для борьбы с хищниками и паразитами . Фармакологические свойства кожи амфибий известны с незапамятных времен и восходят к древней традиционной медицине, использованию в охоте и при изготовлении различных снадобий. Даже сейчас шкурки амфибий и вытяжки из их желез продолжают активно применяться жителями Азии и Южной Америки .