Разработка микрофлюидной аналитической системы для экспрессного определения ДНК методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени

• Автор: Лаврова, Марина Викторовна
• Шифр специальности: 02.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 155 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Микрофлюидные системы в биохимическом анализе.

1.2. Полимеразноцепная реакция развитие метода

1.3. ПЦР анализ в микрофлюидном чипе

1.3.1. Материалы и методы изготовления МФЧ для проведения ПЦР

анализа.

1.3.2. Пассивация внутренней поверхности микрореакторов для проведения

ПЦР анализа.

1.3.3. Поддержание температуры в микрореакторах ПЦРМФЧ методы

определения ампликонов в микроструктурах МФЧ

ГЛАВА 2. ПЦРМИКРОЧИП СОЗДАНИЕ И ОПТИМИЗАЦИЯ
ТОПОЛОГИИ.
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ УСТАНОВКА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ДНК МЕТОДОМ ПЦРРВ В МИКРОРЕАКТОРАХ ПЦР МИКРОЧИПА, ВСПОМОГАТЕЛЬНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ И МЕТОДИКИ.
3.1. Система флуоресцентного детектирования на основе ПЗСматрицы.
3.2. Система термоциклирования на основе термоэлектрического модуля.
3.2.1. Установка для проведения термоциклирования ПЦР смеси в микрореакторах микрочипа
3.2.2. Регулирование температуры в микрореакторах ПЦР микрочипа.
3.2.3. Способы измерения температуры внутри микрореакторов ПЦР микрочипа.
3.3. Растворы, методики и экспериментальные установки, используемые
при проведении экспериментов
3.3.1. Приготовление модельных смесей флуоресцеина и градуировочных растворов для оценки аналитических параметров созданной установки флуоресцентного детектирования
3.3.2. Приготовление растворов родамина В для оценки аналитических параметров созданной установки для проведения термоциклирования.
3.3.3. Приготовление ПЦР смесей и режимы амплификации.
3.3.4. Статическая модификация модельных кремниевых пластин, приготовление растворов и методики обработки пластин
3.3.5. Растворы для динамической модификации модельных кремниевых пластин.
3.3.6. Анализ результатов ПЦР агарозный гельэлектрофорез.
3.3.7. Модификация ПЦР микрочипов
3.3.8. Метод расчета величины порогового цикла ПЦР кривой
3.3.9. Методики очистки ПЦР микрочипа
ГЛАВА 4. ПЦРАНАЛИЗ В СТЕКЛЯННОКРЕМНИЕВОМ МИКРОЧИПЕ
4.1. Оптимизация методов ввода пробы в микрочип
4.2. Предотвращение движения и испарения внутри микроканалов и
реакторов микрочипа при проведении ПЦРанализа.
4.3. Предотвращение сорбции компонентов ПЦР
4.4. Регенерация поверхности микрорсакторов микрочипа после
проведения ПЦР.
ГЛАВА 5. ПЦРАИАЛИЗ В МИКРОРЕАКТОРАХ ПЦР МИКРОЧИПА ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ПРОТЕКАНИЯ РЕАКЦИИ И СРАВНЕНИЕ АНАЛИТИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ СОЗДАННОЙ МИКРОЧИПОВОЙ СИСТЕМЫ СО СТАНДАРТНЫМ ОБОРУДОВАНИЕМ.
5.1. Увеличение селективности определения ДНК методом ПЦРРВ в микрореакторах ПЦР микрочипа оптимизация генерации рспортного
сигнала
5.2. Сравнение аналитических характеристик экспериментальной
установки и стандартного ПЦРРВанализатора
5.3. Создание методики экспрессного определения ДНК методом ПЦРРВ
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Разработанный МФЧ позволяет проводить полный анализ модельной смеси за 3. Небольшая скорость амплификации мин обусловлена большим объемом микрореактора мкл, низкой теплопроводностью стенок микрочипа, выполненного из поликарбоната и использованием внешнего нагревательного элемента. Кроме того, используемые для выделения . ПЦР реакции на , что связано с частичной инактивацией компонентов ПЦР смеси. К достоинствам подхода следует так же отнести высокую эффективность выделения ДНК и отсутствие трудоемких операций при проведении анализа в созданном ПЦРМФЧ, так как весь анализ полностью автоматизирован. В подобных исследованиях заинтересована и корпорация i I ее сотрудниками был разработан биоаналитический стекляннокремниевый МФЧ, позволяющий осуществлять пробоподготовку и ПЦР амплификацию в одном МФЧ, разделенном при помощи одноразового гребневидЕюго фильтра i i, который позволяет осуществлять селективное разделение кровяных телец при постоянной промывке лизирующим буфером через фильтр сначала проходят белые кровяные тельца и только затем красные. После пробоподготовки при помощи обычного шприцевого насоса смесь попадает в амплификационный микрореактор. Термоциклирование осуществляется внешним элементом Пельтье. Анализ ПЦР продуктов производится вне МФЧ при помощи стандартного гельэлектрофореза, поэтому объем конечной ПЦР смеси составляет мкл, что уже довольно близко к стандартным макросистемам, хотя время полного анализа ДНК белых кровяных телец уменьшено в 2 раза за счет бысчрой пробоподготовки пробы. Исходя из рассмотренных подходов по созданию биохимических МФЧ, можно отметить, что большинство исследователей делают попытки реализовать в микрочипе полный цикл ПЦРанализа, от проведения пробоподготовки ускоряющейся по сравнению со стандартными методами в несколько раз за счет уникальных возможностей МФЧ до проведения амплификации ДНК, что связано с возможностью ускорения процессов нагреваохлаждения за счет малого объема микрореактора, высоких коэффициентов теплопроводности материала стенок реактора и возможности интегрирования нагревательных элементов и термодатчиков непосредственно в МФЧ. Ускорение процессов термоциклирования приводит не только к увеличению производительности, но и к повышению селективности анализа уменьшению протекания побочных реакций . Открытие метода ПЦР стало событием в области молекулярной биологии за последние десятилетия. ПЦР это метод, имитирующий естественную репликацию ДНКРНК i viv и позволяющий обнаружить несколько специфических молекул ДНК в присутствии миллионов других 5,. В ходе реакции происходит многократное увеличение числа копий ДНК за счет циклической смены температур и при наличии в смеси ДНКполимеразы I. Этот метод приобрел высокую популярность, и сегодня уже трудно представить работы в области молекулярной биологии без его использования. Особенно бурное развитие метод ПЦР получил благодаря международной программе Геном человека. После появления этого метода началось бурное развитие методов генной инженерии, в частности методов секвенирования при этом используются меченные радиоактивной или флуоресцентной меткой дидезоксинуклеотидтрифосфаты ,, и, если еще недавно время расшифровки последовательности ДНК, длиной, не превышающей 0 п. ДНК размером до п. Для проведения амплификации ДНК необходимы определенные реагенты, которые помещаются в одну пробирку перед началом реакции смесь двух праймеров, ограничивающих анализируемый фрагмент ДНК, термостабильный фермент ДНКполимераза I, впервые выделена из бактерий i, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов ДНТФ основного материала для синтеза нового фрагмента ДНК, буфер для поддержания оптимального и содержащий хлорид магния, для поддержания активности термостабилыюго фермента и, конечно, анализируемый образец ДНКмишень см рис. Кроме того, в смесь добавляют дополнительные компоненты, например бычий сывороточный альбумин, который предотвращает сорбцию основных компонентов смеси на поверхность полимерной пробирки. ПЦР протекает i vi при помощи циклической смены температур .