Ферментативное определение фенолов и ртути (II) с использованием пероксидазы арахиса

• Автор: Багирова, Наиля Арифовна
• Шифр специальности: 02.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 261 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР Глава

Строение и свойства пероксидазы арахиса

1.1. Классификация пероксидаз

1.2. Строение пероксидазы арахиса и других пероксидаз

1.2.1. Общая характеристика структур пероксидаз

1.2.2. Окружение тема в молекуле пероксидаз

1.2.3. Роль ионов кальция в структуре пероксидаз

1.2.4. Углеводная структура пероксидаз

1.2.5. Изоферменты пероксидазы арахиса

1.3. Механизм действия и субстратная специфичность пероксидаз Глава

Ферментативные методы определения фенола и его производных
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Глава
Исходные вещества, посуда, аппаратура, методика эксперимента,
обработка результатов измерений
3.1. Исходные вещества
3.2. Посуда и аппаратура
3.3. Методика эксперимента
3.4. Обработка результатов измерений Глава
Влияние ртутиИ на каталитическую активность пероксидазы арахиса
4.1. Выбор оптимальных условий окисления одианизидииа, катализируемого пероксидазой арахиса
4.2. Влияние ртутиП на каталитическую активность пероксидазы
арахиса в реакции окисления одианизидина
4.3. Выяснение возможных причин различного ингибирующего действия ртугиП на растительные пероксидазы из разных источников
4.3.1. Сравнительное изучение влияние ртутиИ на каталитическую активность пероксидазы арахиса, нативной и рекомбинантной пероксидаз хрена
4.3.2. Влияние ртутиП в присутствии тиомочевины на каталитическую активность различных пероксидаз
4.3.3. Возможные причины различного ингибирующего действия ртутиН на растительные пероксидазы из разных источников
4.4. Определение ртутиН с использованием реакции окисления одианизидина пероксидом водорода, катализируемого пероксидазой арахиса
Влияние фенольных соединений на каталитическую активность пероксидазы арахиса
5.1. Влияние фенола и его производных на кинетику катализируемого пероксидазой арахиса окисления одианизидина
5.1.1. Кинетика и химизм реакции псроксидазного окисления одианизидина
5.1.2. Влияние фенольных соединений на кинетику индикаторного процесса
5.1.3. Причины различного характера влияния фенолов на кинетику пероксидазного окисления одианизидина
5.1.4. Изучение типа ингибирования пероксидазы арахиса фенолами
5.1.5. Спектрофотомегрическос изучение пероксидазного окисления одианизидина в присутствии
ряда фенольных соединений
5.2. Влияние фенольных соединений на кинетику катализируемого пероксидазой арахиса окисления 3,3,5,5тетраметилбензидина
5.2.1. Кинетика и химизм пероксидазного окисления 3,3,5,5тетраметилбснзидина
5.2.2. Влияние ряда фенольных соединений на кинетику индикаторного процесса
5.2.3. Спсктрофотомстрическое изучение совместного псроксидазногоокисления 3,3,5,5тстраметилбензидина и ряда фенольных соединений
5.3. Влияние фенольных соединений на кинетику на кинетику катализируемого пероксидазой арахиса окисления бензидина
5.3.1. Химизм пероксидазного окисления бензидина
5.3.2. Влияние ряда фенольных соединений на кинетику индикаторного процесса
5.4. Влияние фенольных соединений на кинетику катализируемого пероксидазой арахиса окисления офенилендиамина
5.4.1. Кинетика и химизм пероксидазного окисления о фенилендиамина
5.4.2. Влияние ряда фенольных соединений на кинетику шщикаторного процесса
5.4.3. Сиектрофотометричсское изучение системы
о фенилендиамина гидрохинон пероксидаза арахиса пероксид водорода
5.5. Определение фенольных соединений с использованием пероксидазы арахиса
5.5.1. Определение фенолов по реакции пероксидазного окисления одианизидина
5.5.2. Определение фенолов по реакции пероксидазного окисления 3,3,5,5тетраметилбензидина
5.5.3. Определение фенолов по реакции пероксидазного окисления бензидина
5.5.4. Сопоставление результатов определения фенолов с использованием различных индикаторных реакций
и пероксидаз, выделенных из разных источников
5.5.5. Определение фенолов при совместном присутствии с использованием пероксидазы арахиса
5.5.6. Определение фенолов в природной воде ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Так, ближайшим к гему пероксидазы и связанным с атомом железа координационной связью является проксимальный остаток гистидина i 9 рис. Ион железаШ образует четыре координационные связи с атомами азота порфирина и одну связь с белком через азот проксимального гистидина. Шестое координационное место атома железа до сих пор четко не определено. Ранее было показано, что спектры поглощения пероксидазы арахиса и пероксидазы хрена в области Соре нм значительно отличаются от спектра миоглобина, в котором, как и в пероксидазе цитохрома С 3, шестое координационное место железа занимает молекула воды. Данные Рамановской спектроскопии показали, что координационное число железа в геме нативной пероксидазы равно пяти . Это согласуется с результатами, полученными
ноос
Рис. Строение активного центра пероксидаз. Рис. Окружение гема в молекуле пероксидазы арахиса 9. С часть железа находится в пента, а часть в гексакоординационном состоянии, причем доминирует пентакоординационнос состояние . Данные рентгеноструктурного анализа показали, что ближайшая к иону железа молекула воды находится на расстоянии 3,1 в пероксидазе арахиса рис. В непосредственной близости к гсму и проксимальному гистидину в пероксидазе арахиса находится остаток фенилаланина 3 рис. Аналогичным образом фенилаланин расположен около гема пероксидазы хрена и лигнинпероксидазы. В пероксидазах первого класса в этой позиции расположен другой ароматический остаток триптофан. Некоторые пероксидазы содержат в этой позиции остаток лейцина АРХ 7 или метионина. Это свидетельствует о том, что ароматическое взаимодействие здесь несущественно. Связывание молекулы субстратаокислителя пероксида водорода происходит в дистальной гемсвязывающей области пероксидаз. Полость связывания пероксида водорода в молекуле пероксидазы арахиса, так же, как и в пероксидазе хрена и лигнинпероксидазе, образуют остатки аргинина , фенилаланина и гистидина i рис. В пероксидазе цитохрома С место фенилаланина занимает остаток триптофана, однако, все пероксидазы содержат остатки аргинина и гистидина, которые участвуют в кислотноосновном расщеплении связи пероксида водорода 0. Сравнение гемсвязывающих областей разных пероксидаз показало, что аминокислотные последовательности, координирующие гем, отличает высокая гомология рис. Рис. С из дрожжей ССР 3 аскорбатпероксидазы гороха АРХ 4 лигнинпероксидазы I 5 катионной формы пероксидазы арахиса 9 пероксидазы хрена изозима С . Характеристическая особенность строения всех псроксидаз наличие водородных связей между остатками дистального гистидина и аспарагина i и и проксимальным гистидином и аспартатом i 9 и 9 рис. Роль этих водородных связей в пероксидазном катализе будет обсуждаться ниже. Аспарагин также образует водородную связь с консервативным остатком всех псроксидаз глутаматом , лигандом дистального иона кальция. Кроме того, в сети водородных связей пероксидаз участвуют структурные молекулы воды. Водородные связи соединяют белковую глобулу пероксидаз арахиса и хрена и пропионаты гема через остатки , , , 5 и 6 и таким образом связывают дистальную и проксимальную области белка. Результаты атомноабсорбционного анализа показали , что молекула катионной пероксидазы арахиса содержит два иона кальция, которые по данным рентгеноструктурного анализа 9 располагаются в дистальной и проксимальной области белковой глобулы фермешга рис. Аналогичным образом эти катионы располагаются в макромолекулах пероксидазы хрена и лигнинпсроксидазы 5 рис. Более того, в классических псроксидазах ионы кальция связаны с одними и теми же аминокислотными остатками, как правило, карбонильными группами или атомом кислорода боковой цепи. Оба иона кальция в пероксидазах расположены в непосредственной близости к гему и даже структурно связаны с ним рис. Дистальный кальций связан с аспартатом и , I , который соседствует с гистидином и i I i . Второй ион кальция связывается с проксимальным гистидином i 9

I
АЭР 2 ЬУБ
Рис. Центры связывания ионов кальция в дистальной а и проксимальной б областях молекулы пероксидазы арахиса 9.