Пьезокварцевые иммуносенсоры для определения биологически активных веществ и клинической диагностики

• Автор: Калмыкова, Елена Николаевна
• Шифр специальности: 02.00.02
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 310 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Особенности функционирования пьезокварцевых иммуносенсоров в жидких средах.

1.2. Методы иммобилизации биорецспторных молекул.

1.2.1. Физическая сорбция.

1.2.2. Включение в матрицу

1.2.3. Химическая сорбция.

1.3. Условия регенерации биоселектирующих покрытий.

1.4. Виды иммуноанализа с использованием пьезокварцсвого сенсора

1.4.1. 1 рямое детектирование

1.4.2. Одностадийный непрямойконкурентный анализ.
1.4.3. Альтернативный конкурентный анализ.
1.4.4. Двустадийный сэндвичанализ
1.4.5. Анализ с увеличением массы аналита.
1.4.6. Вытеснительный анализ
1.5. Применение ньезокварцевых иммуносенсоров.
1.6. Химическое обоснование классификации грамотрицательных бактерий и роль структурных исследований в установлении их Оантигенной специфичности
1.7. Современные серологические методы лабораторной диагностики кишечного иерсиниоза и аутоиммунных заболевании
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2.1. Химическое и нммунохимическое исследование
Оспецифических полисахаридов У. елегососа.
2.1.1. Общие методы
2.1.2. Наработка микробной массы и выделение липополисахаридов.
2.1.3. Кислотный гидролиз и получение производных моносахаридов для хроматомассспсктромегрии.
2.1.4. Получение производных моносахаридов для иммунохимических исследований и газожидкостной хроматографии.
2.1.5. Выделение и очистка Оспецифических полисахаридов.
2.1.6. Химическая модификация полисахаридов
2.1.7. Ангисыворотки и серологические методы.
2.2. Пьезокварцевое детектирование
2.2.1. Характеристика объектов исследования, химических рсаентов, биополимеров и нммунорсагснтов
2.2.2. Установки для статического и проточноинжекционного анализа жидкостей с применением пьезоквариевых иммуносенсоров.
2.2.3. Подготовка резонаторов и иммобилизация бнорецеиторных молекул
2.2.4. робоподютовка образцов пищевых продуктов, объектов окружающей среды и биологических жидкостей
УСТАНОВЛЕНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СТРОЕНИЯ
ОСПЕЛШФИЧЕСКИХ ПОЛИСАХАРИДОВ У. епгггосоПпса
3.1. Выделение и общая характеристика липополисахаридов
3.2. Установление химического строения Оспецифических
полисахаридов
3.2.1. Химическая структура Ополисахарида
серовараО3.
3.2.2. Химическая структура Ополисахаридов
сероваров и ,
3.2.3. Химическая структура Ополисахарида
серовара , и ,
3.3. Иммунохимическое изучение лнпополисахарндов и их
фрагментов
4. ФОРМИРОВАНИЕ БИОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ 1ЮКРЫТИЙ ЭЛЕКТРОДОВ ПЬЕЗОКВАРЦЕВЫХ
РЕЗОНАТОРОВ
4.1. Физическая сорбция
4.2. Ковалентное прикрепление к подложкам на основе гидрофильных биомакромолскул.
4.3. Формирование подложки с использованием зольгель
метода и самособирающихся монослоев.
4.4. Иммобилизация дифильных макромолекул с направленной ориентацией антигенных детерминант.
5. ИССЛЕДОВАНИЕ ФОРМАТОВ ИММУНОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА С ПРИМЕНЕНИЕМ ПЬЕЗОКВАРЦЕВОГО ДЕТЕКТИРОВАНИЯ.
5.1. Кинетические исследования обратимых гетерогенных иммунохимнческих реакций.
5.2. Прогнозирование чувствительности определения и состава регенерирующего раствора.
5.3. Кроссреактивность антител со структурными аналогами гаптенов.
5.4. Оценка перекрестных взаимодействий Оантигенов
. ii с гомо и гетерологичными агтителами
6. ЗАВИСИМОСТЬ АНАЛИТИЧЕСКОГО СИП 1АЛА СЕНСОРА
ОТ УСЛОВИЙ ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА
6.1. Влияние состава и буферною раствора
6.2. Влияние температуры, продолжительности экспонирования
сенсора, скорости потока раствораносителя
6.3. Выбор растворов для регенерации биоселектирующего слоя
сенсора.
7. РАЗРАБОТКА МЕТОДИК РЕДЕЛЕНИЯ ГА1ТГЕНОВ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ.
7.1. Определение салицилатов в статических условиях.
7.2. Модернизация генератора и создание установки для
проточноинжекционного анализа
7.3. Проточноинжекционное определение салицилатов и сульфаниламидов в фармацевтических препаратах,
объектах окружающей среды и пищевых продуктах.
7.3.1. Определение салициловой кислоты
7.3.2. Определение сульфаметоксазола
7.4. Определение нонилфенола
7.5. Определение метаболита никотина котинина в моче
8. ПРИМЕНЕНИЕ БЕЗОКВАР1 ВОГО ИММУНОСЕНСОРА ДЛЯ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ АУТОИММУННЫХ И
ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ.
8.1. Определение антител к бактериям У. егиегосоШка в
сыворотке крови.
8. 2. Определение антител к ДИК в сыворотке крови
8.3. Определение микроорганизмов бактериофагов У. реяНз и
бактерий К. етегосоНИса серовара в водных растворах
и пищевых продуктах.
ВЫВОДЫ.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ
ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ
ПРИЛОЖЕНИЕ.
ВВЕДЕНИЕ. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность


Основными недостатками физической сорбции является малая величина сорбционной емкости и неустойчивость покрытия, что снижает воспроизводимость определения и срок службы сенсора. Так как этот метод не обеспечивает получения разветвленной поверхности, характерной для ковалентной иммобилизации, чувствительность биослоя невысока . Часто с помощью физической сорбции происходит не только непосредственное формирование биорсцспторного покрытия электрода сенсора, но и создание промежуточного белкового слоя, обеспечивающего достаточно прочное связывание как с металлической поверхностью электрода, так и с молекулами иммунореагентов. В качестве такой белковой прослойки наиболее часто используется белок А , , , . М . С другой стороны, белок А, представляющий собой полипептид из , достаточно активно специфически связывается с молекулами иммуноглобуллинов особенно класса , не затратная при этом активных центров антител, способствуя сохранению активности антител в иммобилизованном состоянии , . Поэтому сенсоры для определения инсулина , некоторых вирусов и бактерий с биорецепторным покрытием, сформированным на основе белка А, показали высокую чувствительность и стабильность работы лаже спустя несколько месяцев. Дальнейшим развитием этого приема является изменение структуры белковой молекулы для повышения прочности связи с золотой поверхностью. С помощью методов генной инженерии в структуру рекомбинантного белка А В5С1 удалось встроить аминокислоты, содержащие сульфгидрильные группы цистеин . Полученная прослойка на основе искусственного белка показала более высокую связывающую активность, по сравнению с обычным белком А, и увеличила продолжительность эксплуатации сенсора без снижения активности. Достаточно распространенным приемом иммобилизации белков является включение в гель , или полимер , , , , , который удерживает рецепторные молекулы за счет физических взаимодействий. Для формирования полимерной матрицы на поверхность очищенного электрода наносят каплю раствора полимера в органическом растворителе и выдерживают до испарения растворителя. Иммобилизацию антител осуществляют погружением сенсора в раствор, при этом антитела кооптируются в полимерный слой. Такой способ иммобилизации антител использован для определения концентрации сывороточного альбумина человека . Сенсоры на основе полимерных матриц активно применялись ранее для определения содержания клеток крови человеческих Глимфоцитов , эритроцитов , и гранулоцитов , однако аналитический сигнат сенсоров был нестабилен при многократных измерениях. Мри получении рецепторного слоя на электрод кристалла наносят раствор полиэтиленамина , или полиэтиленимина в метаноле и после удаления растворителя последовательно выдерживают в растворах глутарового альдегида и соответвующих биомолекул антител или гапенбелковых конъюгатов. При таком способе иммобилизации селектирующий слой сенсора сохраняет активность до дней. Более привлекательны полимерные матрицы, полученные путем элсктрополимеризации или методом тлеющего разряда 5. К полученной таким образом полимерной пленке белковые молекулы прикрепляются ковалентно 5, . Природные биополимеры белки, полисахариды также применяется для иммобилизации рецепторных молекул. Так, в работе предложена методика формирования на поверхности электрода сенсора гидрогеля па основе бычьего сывороточного альбумина и антител. Полученный биочувствитедьный слой характеризуется высокой чувствительностью и стабильностью. В связи с тем, что при гидрофобизации и функпионализации поверхности увеличивается прочность закрепления биорецепторного слоя, в последнее время полимерные пленки чаще выступают в роли подложки для повышения адгезии биомолекул. С помощью химической сорбции белков получают насыщенные плотные, трудно разрушаемые слои, устойчивые при анализе жидких сред . Такой метод предпочтителен для проточного или прогочноинжскцноиного анализа. При ковалентной иммобилизации происходит более прочное закрепление биослоя на электроде, что снижает потери при длительном контакте его с жидкостью, обеспечивает более высокую воспроизводимость аналитического сигнала и многократность использования иммобилизованной твердой фазы после регенерации.