Хроматографическое и электрофоретическое определение стероидов и биогенных аминов в биологических объектах

• Автор: Бессонова, Елена Андреевна
• Шифр специальности: 02.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 201 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ

1.1. Общие сведения о стероидных гормонах и их классификация

1.2. Биосинтез и метаболизм кортикостероидов. Биологические формы

и действие кортикостероидов в организме.

1.3. Физикохимические методы исследования стероидных гормонов

1.3.1. Иммунологические методы.

1.3.2. Хроматографические методы анализа стероидных гормонов.

1.3.2.1. Определение стероидов методом тонкослойной хроматографии.

1.3.2.2. Газовая хроматография ГХ и хроматомассспектрометрия ГХМС при определении стероидов.
1.3.2.3. Определение стероидных гормонов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии ВЭЖХ
1.3.2.3.1. Использование циклодекстрипов ЦД в хроматографии стероидов.
1.3.2.3.2.Методы детектирования стероидных
гормонов
1.3.2.4. Мицеллярная жидкостная хроматография.
1.3.3. Определение кортикостероидов методом мицеллярной
электрокинетичсской хроматографии МЭКХ
1.3.3.1. Поверхностноактивные вещества, используемые в МЭКХ для разделения стероидных гормонов.
1.3.3.2. Буферные системы, используемые в МЭКХ стероидов
1.3.3.3. Влияние модификаторов в составе ведущего электролита на разделение кортикостероидов методом МЭКХ
1.4. Подготовка биологических объектов к анализу.
1.4.1. Гидролиз конъюгатов стероидов
1.4.2. Методы экстракции стероидных гормонов
1.5. Биосинтез и метаболизм катехоламинов.
1.6. Физикохимические методы исследования катехоламинов
1.6.1. Иммунологические методы определения катехоламинов
1.6.2. Газовая хроматография для определения катехоламинов
1.6.3. Высокоэффективная жидкостная хроматография ВЭЖХ катехоламинов.
1.6.4. Использование метода капиллярного электрофореза КЭ для определения катехоламинов КА
1.6.5. Детектирование катехоламинов в ВЭЖХ и КЭ
1.6.6. Сравнительный анализ физикохимических методов
определения катехоламинов.
1.6.7. Пробоподготовка реальных объектов к анализу
катехоламинов.
ГЛАВА 2. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Аппаратура
2.2. Реактивы и материалы
2.2.1. Подготовка рабочих растворов
2.2.2. Отбор пробы.
2.3. Методы исследования
2.3.1. Высокоэффективная жидкостная хроматография при определении стероидов и катехоламинов.
2.3.2. Капиллярный электрофорез
2.4. Подготовка биологических объекгов к анализу.
2.4.1. Подготовка биологических объектов к анализу смесей
стероидных гормонов.
2.4.1.1. Жидкостная экстракция
2.4.1.2. Твердофазная экстракция
2.4.1.3. Определение стероидных гормонов методом ТСХ
2.4.2. Оптимизация пробоподготовки при определении
катехоламинов.
2.4.2.1. Подготовка сорбента для экстракции
катехоламинов
2.4.2.2. Твердофазная экстракция катехоламинов
ГЛАВА 3. УСТАНОВЛЕНИЕ ФАКТОРОВ, ВЛИЯЮЩИХ НА ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ОФ ВЭЖХ И
ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ МИЦЕЛЛЯРПАЯ
ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ РАЗДЕЛЕНИЕ КОРТИКОСТЕРОИДОВ.
ЗЛ Факторы, влияющие на разделение стероидов в режиме ОФ
3.2. Влияние добавки Рциклодекстрина на разделение стероидных
гормонов в изократическом режиме ОФ ВЭЖХ
3.3 Расчет констант устойчивости, образующихся комплексов
между рциклодекстрином и стероидами
3.4. Сравнительная оценка жидкостной и твердофазной экстракции
при определении кортикостероидов в сыворотке крови и в моче
3.5. Факторы, влияющие на разделение кортикостероидов методом мицеллярной электрокинетической хроматографии.
3.6. Методы i концентрирования в МЭКХ при определении стероидных гормонов в биологических жидкостях.
3.7. Определение стероидов в биологических объектах методом
3.8. Сопоставление полученных результатов в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии с методом ОФ ВЭЖХ
ГЛАВА 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАТЕХОЛАМИНОВ МЕТОДАМИ КЭУФ И КЭМС
4.1. Факторы, влияющие на разделение катехоламинов в капиллярном зонном электрофорезе.
4.2. Факторы, влияющие на стабильность электрораспыления и чувствительность ЕМ8детектирования.
4.3. Определение катехоламинов в реальных объектах методом КЭМС
4.4. Сопоставление методов КЭМС и ОФ ВЭЖХ при определении катехо ламинов.
ГЛАВА 5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИЛОЖЕНИЕ
5.1. Закономерности изменения стероидных профилей при различных
дисфункциях коры надпочечников
5.1.1. Подготовка пробы к анализу.
5.1.2. Характеристические стероидные профили при различных дисфункциях коры надпочечников методом ОФВЭЖХ
ПРИЛОЖЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


В основе этих методов специфическая реакция антигенантитело. Существует несколько вариантов иммунологического определения стероидных гормонов главным образом, кортизола и тестостерона иммуноферментный анализ ИФА, радиоиммуиологичсский анализ РИА, флуоро и хемилюминесцентный иммуноанализы 3. Таблица 1. Прогестерон Рг М 0, 0. Дезоксикортизол 1,, Андростендион . Разделяют свободную и связанную формы анализируемого стероида. И, наконец, рассчитывают количество аналита в пробе. Селективность реакции антитела с конкретным стероидом не абсолютна в присутствии гормонов, имеющих близкое строение, антитело может вступать с ними в перекрестные реакции, и результаты будут завышены. Для определения кортикостероидов широко используется газовая хроматография ГХ 3, и хроматомассспектрометрия ГХМС , высокоэффективная жидкостная хроматография ВЭЖХ 4, и ее сочетание с массспектрометрией и хроматография в тонком слое ТСХ . До активного внедрения ВЭЖХ именно метод ТСХ использовали для идентификации стероидных гормонов в биологических объектах. Разделение стероидов осуществляют обычно на слое силикагеля с использованием различных элюирующих систем гексапэтилацетат , бензолацетон , бензолэтанол , беизолэтилацетат 3, хлороформэтанол , толуолэтанол , голуолацетонуксусная кислота, хлороформметанолвода 0,8 3, хлороформацетон 3 , этилацетатметанолвода 1, метаиолвода 9 и др. В скобках даны объемные соотношения. Обычно проводят многократное элюирование . Кроме силикагеля для разделения кортикостероидов, предлагаются полиамидные сорбенты ЬН, целлюлоза с 1,2пропандиодовой пропиткой и силикагель, обработанный щелочыо и формамидом 3. Для детектирования стероидных гормонов в ТСХ чаще всего используется серная кислота разбавленная водой или спиртами, иногда в сочетании с альдегидами наблюдается разнообразное окрашивание зон в зависимости от типа стероида 3,. Специфичным реагентом для кортикостероидов является тетразолисвый синий также применяют фосфорную и соляную кислоты, хлорид сурьмы ГП, пары йода . К о гичествешшй анализ осуществляют с использованием сканирующих денситометров . В настоящее время ТСХ используется в основном для выделения кортикостероидов из биологических образцов. Первые работы, посвященные анализу стероидов методами ГХ, были опубликованы в г. Е. Для этой цели использовались в основном стеклянные и реже металлические насадочные колонки 8,. Неподвижную фазу наносили на специально подготовленный белый диатомитовый поситель. Наибольшее применение в качестве неподвижных фаз нашли полиметилсилоксаны и метилфенилсиликоновые фазы 8,. Анализируемые стероиды обычно термически неустойчивы, поэтому при ГХонределении их практически всегда переводят в более летучие и стабильные производные 8,,. Для детектироватшя используют ионизационнопламенный ДИП и фотопламенный детекторы, хроматомассспектрометрометрию ГХМС и детектор электронного захвата ДЭЗ 8,. С появлением техники термораспыления , позволяющей осуществлять ионизацию при атмосферном давлении и сравнительно низких температурах, стало возможным сочетание работы массспектрометра с жидкостным хроматографом, чго устранило необходимость предварительного силилирования аналитов. З.2. З. Определение стероидных гормонов методом высокоэффективной жидкостной хроматографией ВЭЖХ. Начиная с х гг. XX в. ОФ ВЭЖХ 4, табл. Для определения кортикостероидов применяют нормально и обращеннофазовую ВЭЖХ. В случае модифицированного силикагеля, в качестве элюента используют хлороформ, дихлорметан, в которые добавляется незначительное количество этанола или метанола, диоксана или тетрагидрофурана. В нормальнофазовом варианте достаточно трудно получать воспроизводимые результаты, что связано с адсорбцией воды из растворителей, применяемых в качестве подвижных фаз, а также изза достаточно длительного установления равновесия при замене элюента. В настоящее время нормальнофазовая ВЭЖХ определения стероидов практически полностью уступила месш обращеннофазовой. Установлено, что неподвижные фазы я. ЭТОТ, обеспечивают наилучшее разделение стероидов и имеют преимущество перед другими н.