Электрофоретическое определение нейротрансмиттеров в биологических объектах с использованием OFF-LINE и ON-LINE концентрирования

• Автор: Сидорова, Алла Анатольевна
• Шифр специальности: 02.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 184 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ

1.1. Общая характеристика нейротрансмиттеров.

1.2. Методы определения нейротрансмиттеров в биологических

объектах

1.2. 1. Иммунологические и радиохимические методы анализа

1.2. 1. 1. Иммунологический анализ.

1.2. 1.2. Радиоферментный анализ.

1. 2. 2. Газовая хроматография

1.2. 2. 1. Силилирование.

1. 2. 2. 2. Алкилирование

1. 2. 2. 3. Ацилирование.
1.2.3. Определение биогенных аминов и аминокислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
1.2. 3. 1. УФ и флуориметрическое детектирование
1. 2. 3. 2. Электрохимическое детектирование.
1.2.4. Метод высокоэффективной тонкослойной хроматографии ВЭТСХ
1.2.5. Метод капиллярного электрофореза КЭ при определении нейротрансмиттеров.
1. 2. 5. 1. Основы метода капиллярного электрофореза.
1. 2. 5. 2. Основные варианты капиллярного электрофореза КЭ.
1. 2. 5.2. 1. Капиллярный зонный электрофорез КЗЭ.
1.2. 5.2. 2. Мицеллярная электрокинетичсская хроматография
1. 2. 5. 3. Методы детектирования в капиллярном электрофорезе.
1. 2. 5. 3. 1. УФдетектирование в капиллярном элекгрофорезе.
1. 2. 5. 3. 2. Флуоресцентное детектирование
1. 2. 5.3. 3. Электрохимическое детектирование
1. 2. 5. 3. 4. Массспектрометрическое детектирование.
1. 2. 5. 4. Возможности i концентрирования в КЭ.
1.2.5.5. Эффективность, разрешение и селективность разделения в
методе капиллярного электрофореза.
1. 2. 5. 6. Характеристика макроциклических реагентов,
используемых в капиллярном электрофорезе
1.3. Пробоподготовка биологических объектов к электрофоретическому определению биогенных аминов и аминокислот.
1.3. 1. Твердофазная экстракция.
1. 3. 2. Жидкостная экстракция катехоламинов
1. 3. 3. Жидкостная экстракция аминокислот
ГЛАВА 2. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
2. 1. Аппаратура.
2. 2. Реагенты.
2. 3. Методы исследования
2 .3 .1. Метод капиллярного электрофореза с УФдетектированием
2. 3. 2. Метод капиллярного электрофореза с МСдетектированием
2.3.3. i концентрирование в режиме капиллярного
электрофореза.
2. 3.4. Метод высокоэффективной тонкослойной хроматографии
2. 3. 5. Использование обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с амперометрическим детектированием
при определении катехоламинов.
2.3.6. Массспектрометрический анализ реальных объектов и
индивидуальных нейротрансмиттеров.
2. 3. 7. Пробоподготовка биологических объектов к анализу.
ГЛАВА 3. ВЫЯВЛЕНИЕ ДОМИНИРУЮЩИХ ФАКТОРОВ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ НЕЙРОТРАНСМИТТЕРОВ
3. 1. Нейротрансмиттеры. Задачи и проблемы их определения в биологических жидкостях.
3.2. Установление факторов, влияющих на электрофоретическое разделение биогенных аминов
3.2. 1. Оптимизация электрофоретического разделения биогенных аминов методом капиллярного электрофореза с УФдетектированием
3.2. 1.1. Оценка констант устойчивости комплексов биогенных аминов с краун
3.2. 1.2. Сравнительные оценочные характеристики влияния макроциклов, ионпарного агента и органического растворителя на электрофоретическое разделение аналитов
3.2.2. Влияние циклодскстрина на электрофоретические характеристики нейротрансмиттерных ароматических кислот
3.2.2.1. Оценка констант устойчивости комплексов ароматических кислот с циклодекстрином
3.2.3. Определение ароматических кислот методом МЭКХ с УФ
детектированием
3.2. 4. Выяснение возможностей электрофоретического определения алифатических аминокислот методом капиллярного электрофореза с УФдетектированием без предварительной дериватизации и с использованием фенилтиокарбамоильных производных.
3.2.5. Изучение кинуренинового пути метаболизма триптофана методами капиллярного электрофореза.ИЗ
3.2.6. Определение биогенных аминов методом капиллярного электрофореза с массспектрометрическим детектированием
3.2.7. i концентрирование в режиме капиллярного электрофореза.
3. 3. Хроматографическое определение нейротрансмиттеров.
3.3.1. Анализ катехоламинов методом ОФ ВЭЖХ с амперометрическим детектированием.
3.3.2. Определение триптофана и его метаболитов методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии
3.4. Массспектрометрическое определение нейротрансмиттеров на
приборе I V .
3. 5. Пробоподготовка биологических жидкостей к анализу
3.5. 1. Оптимизация условий пробоподготовки биологических
объектов для массспектрометрического анализа
3.5.2. Пробоподготовка биологических жидкостей для
электрофоретического и хроматографического определения.
3.5.2.1. Твердофазная экстракция катехоламинов на
активированном оксиде алюминия
3. 5. 2. 2. Твердофазная экстракция катехоламинов на
силикагеле
3. 5. 2. 3. Твердофазная экстракция катехоламинов на
модифицированном С
ГЛАВА 4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ
4. 1. Определение лекарственного препарата Алкеран
4. 1. 1. Определение мелфалана в режиме капиллярного зонного электрофореза
4.2. Определение 3гидроксикинуренина в структурах мозга Дрозофил
4. 2. 1. Кинурениновый путь метаболизма триптофана.
4. 2. 2. Оптимизация условий определения и разделения метаболитов кинуренинового пути триптофана в режиме капиллярного
электрофореза
4. 2. 3. Определение 3гидроксикинуренина, кинуренина и триптофана в реальном образце методом капиллярного электрофореза
4.3. Определение катехоламинов в биологических жидкостях при сердечнососудистых заболеваниях.
ПРИМЕЧАНИЯ
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Ш почечный гормон мозгового вещества надпочечников. Он и норадреналин синтезируются в особых секреторных клетках хромаффинной ткани. Другим источником норадреналина является симпатическая нервная ткань. Дофамин предшественник норадреналина в процессе биосинтеза. Как и норадреналин, он является медиатором симпатической нервной системы. ДОФАООРА д игид р оксифен илапа нин
3. ОСН3 В анилил миндальная кислота УМА
ш
гу. Рис. Структурные формулы катехоламинов, их метаболитов и нейротрансмиттерных аминокислот. Основной путь образования катехоламинов в организме представлен на следующей схеме 3 Рис. Рис. Схема синтеза катехоламинов. РММТфенилэтаноламинЫметилтрансфераза. Многочисленные исследования в области биохимии биогенных аминов свидетельствуют о доминирующей роли этих соединений в деятельности центральной нервной системы нарушение обмена катехоламинов является причиной различных нервных и психических заболеваний. Метаболизм дофамина ОА приводит к образованию 3,4 дигидроксифенилуксусной кислоты ООРАС и гомованилиновой кислоты НУА, хорошо известных кислотных метаболитов Рис. Конечный продукт метаболизма адреналина и норадреналина ванилилминдальная кислота УМА 3 Рис. УМА метаболиты катехоламинов важнейшие диагностические маркеры таких заболеваниях как нейробластома злокачественная опухоль и феохромоцитома 3. Рис. Рис. Концентрации биогенных аминов в биологических жидкостях на уровне нормы охватывают довольно широкий диапазон табл. Таблица 1. Нормы биогенных аминов в биологических жидкостях 1, 2, 3, 8, 9. Иммунологические и радиохимические методы анализа 1. Иммунологический анализ Для определения биогенных аминов достаточно широко распространены иммунологические методы анализа 3, 5, позволяющие селективно определять макромолекулярные вещества протеины и полисахариды и малые молекулы гормоны и лекарственные вещества в составе биологических объектов. Их высокая специфичность основана на гнсдиолспецифичном сродстве геля к экстрагируемым из реальных объектов катехоламинам. Количество ферментсвязанных антигенов обратно пропорционально концентрации катехоламинов 2. Метод основан на введении в молекулу катехоламинов радиоактивной метки. В основе радиоферментного анализа лежит специфическая реакция антиген антитело. В настоящее время этот метод для определения катехоламинов в лабораторной практике не используют. Однако в гг. При этом возможно анализировать только смеси летучих и термостабильных соединений, поэтому для определения аминокислот требуется проводить предварительную дериватизацию. Если газовый хроматограф снабжен массспектрометрическим детектором, то дериватизацию обычно проводят для дофамина и норадреналина с использованием в качестве реагента дериватизации третбутилдиметилхлорсилана или пентафторпропионового ангидрида для метоксикатехоламинов 3. Существуют и другие способы получения производных . Удобным методом дериватизации является получение эфиров ациламинокислот с этерификацией карбоксильной группы. Наибольшее распространение получили трифторацетильные производные 3. Получение производных осуществляется при С в течение мин , . Для последующего газохроматографического анализа обычно используется капиллярная колонка I 5 СВ 0 диметилполисилоксана, 0. В определяли силильные производные аминокислот, найденные в метеоритах аланин , валин V, серии , пролин , аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота . Алкилирующим реагентом может выступать метанол, алкилгалогенид, диметилформамид. Используют также соли тетраалкиламмония . Реагент не чувствителен к присутствию воды, что позволяет проводить экстракцию в образцах, содержащих влагу. Элюирование производных аминокислот достигается менее чем за мин, а выход реакции составляет . Преимущества данного метода простота, легкость автоматизации, хорошая растворимость аминокислот в реагенте. Однако воспроизводимость получаемых результатов недостаточна. Алкилхлорформиаты могут реагировать с первичной и вторичной аминогруппой в водной среде , , . Реакция аминокислот с хлорформиатом при комнатной температуре идет с высоким выходом .