Иммобилизация пероксидазы хрена на водном силикагеле и СВ-1 с целью дальнейшего использования в аналитической химии

• Автор: Котляр, Елена Геннадьевна
• Шифр специальности: 02.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Астрахань
• Количество страниц: 179 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ.
ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ИСТОЧНИКОВ ИНФОРМАЦИИ.

1.1. Структура и свойства пероксилазы

1.2. Определение пероксидаз, их активности i viv и i vi

1.3. Использование пероксидазы, иммобилизованной на различных носителях.

1.4. Использование в иммуноопределении пероксидаз различного происхождения

1.5. Миметические пероксидазы.

1.6. Применение пероксидазы хрена в аналитической химии.

1.7. Возможные направления для проведения исследований

IIАДСОРБЦИЯ НЕОРГАНИЧЕСКИХ И ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ НА ОКСИДАХ АЛЮМИНИЯ, КРЕМНИЯ И СОРБЕНТАХ СВ.
2.1. Общее положение теории сорбции.
2.1.1. Изотермы адсорбции
2.1.2. Площадь, занимаемая одной адсорбированной молекулой
2.1.3. Аттракционное взаимодействие.
2.2. Адсорбируемость
2.2.1. Влияние на адсорбируемость природы сорбента
2.2.2. Влияние на адсорбируемость природы растворителя
2.2.3. Влияние на адсорбируемость электронного и молекулярного строения сорбата.
2.3. Общие вопросы хе.мосорбции.
2.4. Адсорбция с участием свободной пары электронов.
2.4.1. Кислород и азотсодержащие поверхностноактивные вещества
2.4.2. Серосодержащие вещества
2.4.3. Природа адсорбционных сил.
III. ИЗУЧЕНИЕ СОРБЦИОННОГО КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА ПХ НА РАЗЛИЧНЫХ СОРБЕНТАХ
3.1. Определение активности пероксидазы хрена в корнях растений
3.2. Изучение процессов сорбции пероксидазы хрена на различных сорбентах
3.2.1. Изучение сорбционной способности неорганических сорбентов по отношению к пероксидазе хрена.
3.2.2. Влияние на иммобилизацию пероксидазы хрена па водном силикагеле и СВ1.
3.2.3. Изучение процесса сорбции пероксидазы хрена на водном силикагеле и СВ1.
3.2.4. Изучения влияния сорбента на ферментативную активность пероксидазы хрена.
IV. КВАНТОВОХИМИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОЦЕССА СОРБЦИИ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА.
4.1. Краткий обзор использованных методов
4.1.1. Метод полного пренебрежения дифференциальным перекрыванием.
4.1.2. Метод I
4.1.3. Краткая характеристика методов АМ1 и РМЗ.
4.2. Теоретическое обоснование протекания процесса иммобилизации пероксидазы хрена па водном силикагеле и СВ1 в кислой среде.
4.2.1. Моделирование сорбции пероксидазы хрена на водном силикагеле и СВ1 3.
V. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИММОБИЛИЗОВАННОГО ФЕРМЕНТА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
5.1. Изучение возможности определения гидроксилсодержащих органических соединений.
5.2. Фотометрический метод определения фенолов и адреналина с использованием иммобилизованной на СВ1 ПХ.
5.3. Тнтриметрический метод определения фенолов и адреналина с использованием иммобилизованной на СВ1 Г1Х
5.4. Моделирование системы проточноинжекционного анализа ФЛВ с
использованием иммобилизованной ПХ.
ВЫВОДЫ.
ЛИТЕРАТУРА


Описана методика потенциометрического определения пероксидазы хрена в проточноинжекционной системе, основанная на реакции Н2 с пфторфенолом в присутствии пероксидазы хрена, выделении в результате реакции иона и детектировании его при помощи индикаторного селективного электрода. Кроме того, пероксидазу хрена капсулируют в липосомы, в результате высвобождения из которых образуется более интенсивный аналитический сигнал. Разработана схема проточноинжекционной ячейки и описано се устройство, Включение в систему дополнительного промывного канала обеспечивает отмывку электрода от загрязнений и быстрый электродный отклик. Применение в качестве промывного раствора смеси ацетатного буферного раствора с Тритоном X0 улучшает динамику отклика электрода приблизительно в 3 раза, при этом чувствительность определения возрастает более чем на . Основными достоинствами предложенной проточноинжекционной системы являются возможность определения низких уровней активности ферментов, быстрая отмывка электрода и увеличение производительности анализа до пробч . Изучено применение микропероксидазы с активностью, аналогичной пероксидазе, для фотометрического определения гидропероксидаз липидов, основанного на окислительном сочетании 4аминоантипирина и ,диэтиланилина с гидропероксидазами при действии микропероксидазы с образованием фиолетовых продуктов реакции. Пробу раствора гидропероксидаз либо пробу масла до 0, г или жира до 0,2 г разбавляют спиртом до объема 1 см3, прибавляют 2 см3 1ного раствора КаОН в МеОН и встряхивают 5 мин. Затем вносят 0,4 см3 0,5 М НзвОд, 1 см3 Трисбуферного раствора 7,2, 2 мл МеСЫ, 1 мл 0,5ного раствора 4аминоантипирина, 0,2 см3 раствора ,Ь1 диэтиланилина и 1 мл раствора микропероксидазы 2нг в 0 см3 воды. Смесь встряхивают I мин и выдерживают мин при С, а затем измеряют оптическую плотность при 4 нм. Методика с успехом использована для определения гидропероксидаз метиллинолеата, третбутилгидропероксидаз и гидропероксидаз в маслах и жирах. Полученные результаты близки к найденным иодометрнческн. Метод позволяет определять гидроперокевдазы при содержании их 0,5 0, мкМоль . Разработана методика детектирования и определения активности пероксидазы, основанная на визуальном наблюдении развития коричневой окраски вследствие реакции пероксидазы с гвояколом в присутствии Н2 . Пероксидазы пероксидазу хрена, альбумин сыворотки крови быка и рибонуклеазу А разделяют на фракции по 2 см3 методом хроматографии на колонке 1,6 см с ссфакрилом 8 0 используя в качестве подвижной фазы 0,1 М ацетатный буферный раствор с 5 расход подвижной фазы равен 0, см3мин. М раствора гадропенпероксидазы, пластинку выдерживают 5 мин и наблюдают развитие коричневой окраски . Описана методика флуориметрического определения активности пероксид азы хрена и микропероксидазы, основанная на использовании их каталитического влияния в реакции между 1,2диарилэтилендиаминамн и катехиновымн соединениями в качестве флуорогенных субстратов в присутствии Н2. Для практических целей рекомендовано использовать сочетание мезо1,2 дифенилэтнлендиамина и эпинефрина. М для пероксидазы хрена, 6,3 для микропероксидазы, мМ для микропероксидазы, 1 см3 мМ фосфатного буферного раствора 7,0 для пероксидазы хрена, 6,3 для микропероксидазы, 1 см3 раствора Н2 0,6 или 2 мМ для пероксидазы хрена, см3 для микропероксидазы и 0,1 см3 раствора пробы пероксидазы хрена или микропероксидазы. Реакцию останавливают охлаждением смеси в ледовой бане и измеряют, интенсивность флюоресценции реакционной смеси при длинах волн возбуждения и испускания 0 и 0 нм соответственно. Относительное стандартное отклонение для пероксидазы хрена и микропероксидазы составляет 0. Разработан способ предсказания сроков овуляции, основанный на определении изменения содержания пероксидазы в цервикальной слизи с помощью тестового приспособления , состоящего из трехкомпонентной системы реактивов пероксид Н2 или пероксид мочевины, цветореагент 2,2азинобие Зэтилбензотиазолнн6сульфокислота и солюбилизатор 1 ,а. Ыацетилглкжозаминидаза или СаС. Для всех компонентов системы реактивов устанавливали в интервале от 4 до 6. Каждый компонент системы реактивов готовят в виде тонкой гелеобразной пластинки с помощью гидрофильных коллоидообразователей поливинилпирролидон, альгинаты, агароза, желатина или акрилаты.