Определение следовых концентраций аминокислот, различных органических кислот и сахаров при их совместном присутствии методом реакционной хромато-масс-спектрометрии в водных и органических растворах

• Автор: Соболевский, Тимофей Геннадьевич
• Шифр специальности: 02.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 178 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕТУЧИХ ПРОИЗВОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ, РАЗЛИЧНЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ И САХАРОВ ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Газохромлтогрлфический анализ аминокислот

1.2. ГлЗОХРОМЛЮГРЛФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЖИРНЫХ, ДИКАРБОНОВЫХ, ГИДРОКСИ, оксокислот, СПИРТОВ, САХАРОЗ И РОДСТВЕННЫХ СОЕДИНЕНИЙ .

ГЛАВА 2. ОБОРУДОВАНИЕ, ИСХОДНЫЕ ВЕЩЕСТВА И МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА.

2.1. Оборудование

2.2. ИСХОДНЫЕ ВЕЩЕСТВА И МАТЕРИАЛЫ

2.3. МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА

2.3.1. Приготовление растворов модельных соединений.

2.3.2. Деризатизаиия аминокислот с использованием гексаметилдисилазана .

2.3.3. Деризатизаиия модельных соединений с использованием .бистриметилсилилтрифторацетамида и
третбутилдиметилсилилтрифторацетамида.
2.3.4. Дериватизация аминокислот с использованием изобутилхлорформиата
2.3.5. Дериватизация жирных и дикарбоновых кислот с использованием изобутилхлорформиата
2.3.6. Приготовление лиофилизированных препаратов культуральной жидкости с клетками бактерий ii i
2.3.7. Приготозление клеточных культур фибробластов и аденокарциномы прямой кишки человека .
2.3.8. Экстракция из лиофилизата ii i.
2.3.9. Дериватизация экстрактов из реальных образцов
2.3 Газохроматографическое определение продуктов дериватизации
2.3 Массспектрометрическая идентификация продуктов дериватизации . ГЛАВА 3. ДЕРИВАТИЗАЦИЯ МОДЕЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ И ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ГХМС ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕТУЧИХ ПРОИЗВОДНЫХ
3.1. Оптимизация условий глзохроматогрлфического определения
3.2. СИЛИЛИРОВЛПИЕ ЖИРНЫХ. ДИКАРБОНОВЫХ. ГИДРОКСИ, ОКСО И АМИНОКИСЛОТ. СЛХЛР, СПИРТОВ И СТЕРОЛОВ.
3.2.1. Дериватизация гексаметилдисилазаном
3.2.2. Дериватизация Ы.Обистриметилсилилтрифторацетамидом
3.2.3. Дериватизация аминокислот
третбутилднметилсилилтрифторацетамидом
3.3. Э1ЕРИФИКАЦИЯ И ЛЦИЛИРОЗАНИЕ ЖИРНЫХ. ДИКАРБОНОВЫХ И АМИНОКИСЛОТ
3.3.1. Дериватизация изобутилхлорформиатом.
ГЛАВА 4. ХРОМАТОМАСССПЕКТРОМЕТРИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПРОДУКТОВ ДЕРИВАТИЗАЦИИ ИЗУЧАЕМЫХ СОЕДИНЕНИЙ .
4.1. Электронная ионизация.
4.1.1. Изучение массспектров силильных эфиров жирных, дикарбоновых. гидрокси, оксо и аминокислот, сахаров, спиртоз и стеролов и оценка пределов детектирования.
4.1.2. Изучение массспектров изобутоксикарбонильных эфиров аминокислот и алкиловых эфироз жирных и дикарбоновых кислот и оценка пределов детектирования.
4.2. Химическая ионизация
4.2.1. Изучение массспектров силильных эфиров гидрокси, оксокислот, сахаров, спиртов и стеролов и оценка пределов детектирования.
4.2.2. Изучение массспектров изобутоксикарбонильных эфиров аминокислот и алкиловых эфиров жирных и дикарбоновых кислот и оценка пределов
детектирования.
ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА СОЕДИНЕНИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР
5.1. Определение состава соединений, выделенных из лиофилизировлнной культуры ii Сои
5.2. Определение состава жирных, дикарбоновых и аминокислот в клетках ЛДЕИОКАРЦИНОМЫ И ФИБРОБЛЛСЮВ ЧЕЛОВЕКА
ГЛАВА 6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СЛЕДОВЫХ СОДЕРЖАНИЙ АМИНОКИСЛОТ В ВОДНЫХ
РАСТВОРАХ.
6.1. Изучение возможносш сорбционного концентрирования следовых количеств
ИЗОБУЮКСИКЛРБО 1ИЛЫ1ЫХ ПРОИЗВОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ ИЗ ОРГЛНтЕСКОГО РАСТВОРА и ГХ
МС АНАЛИЗА ВСЕГО КОНЦЕНТРАТА
3 АКЛЮЧ ЕНИ Е.
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Подобные анализы востребованы в медицинской диагностике, в биотехнологии и микробиологических исследованиях, в контроле качества различных пищевых продуктов, напитков, а также при определении характерного состава соединений указанных классов в различных фруктах и овощах. В настоящее время для определения этих классов соединений используется реакционная газовая, высокоэффективная жидкостная и иногда ионообменная хроматофафия РГХ, БЭЖХ и МОХ, соответственно, а также капиллярный электрофорез в случае аминокислот. Б случае БЭЖХ, как, например, показано в работе 1 пнтсфироваппое пульсирующее ампсромстричсскос детектирование аминокислот и глюкозы при одновременном присутствии данных о пределах дегектированпя пет, и ИОХ 2 постколоиочная дерпватизация офталальдегидом с последующим флуоресцентным дегектированисм пределы детектирования на уровне 5х 5, принципиально возможен непосредственный анализ таких соединений, хотя при работе с реальными образцами обычно трсбуегся стадия очистки и выделения отдельных фупп соединений. Однако в силу ряда инструментальных и мегодичсских сложностей эти методы мало пригодны для анализа различных классов соединений при их одновременном присутствии. Газохроматофафичсский анализ данных классов соединений требует предварительного получения летучих производных дериватизации. Сущесгвуег достаточно большое число методов и реагентов, основанных на различных химических реакциях 3, главным образом этерифнкацнн, ацилироиания и алкилироваппя. Следует заметить, что в довольно большом числе публикации для регистрации компонентов используют пламенноионизационный детектор ПИД, который сам по себе не может обеспечить необходимой чувствительности и селективности определения и требует предварительного анализа стандартных растворов изучаемых соединений, исключая тем самым возможность достоверной идентификации неизвестных компонентов. Дериватизация аминокислот представляет собой наиболее сложную задачу, поскольку эти соединения отличаются разнообразием химической структуры, включая, помимо собственно амино н карбоксильной групп, также алифатические и ароматические гндроксигруппы, имино, амидо и гуанидиногрупиы. В настоящее время существует несколько способов получения летучих производных аминокислот. Одно из первых детальных исследований в области газохроматографического анализа аминокислот было проведено Герке СсЬгкс с сотр. На каждом этапе дерпватизации требовалось высушивание реакционной смеси досуха. Дерпватизации предшествовала длительная пробоподготовка с использованием ионообменных смол для выделения аминокислот из матрицы плазма крови, моча. Пределы детектирования составили 2 пг в случае уУтрнфторацетильны. КСНСООПн. Уэлектроиозах ватного детектора. В настоящее время этот способ дерпватизации аминокислот применяется очень редко. Тем не менее, авторы работы 6 предлагают использовать его для быстрой диагностики феиилкстонурии и других ацндсмий, связанных с нарушением метаболизма аминокислот. В данной работе проводили определение только пяти соединений валика, лейцина, пролипа, фенилаланина и тирозина. Пределы детектирования составляли около 0. ЭИ. В работе 7 анализировали аминокислоты в виде УУтр и фтор ацетил изопропиловых эфиров, которые получали по стандартной методике. Были изучены массспектры ЭИ и ХИ с регистрацией положительных ионов газреагент метан для производных аминокислот, включая аргинин. Данных о пределах детектирования не приводится. Параллельно с анализом аминокислот в виде УУтр и фтор ацетил бутиловых эфиров, Гсркс вел исследования по получению триметилсилильных производных аминокислот 8. Раствор аминокислот в 0. М соляной кислоте упаривали досуха в токе азота, остатки воды удаляли с помощью днхлорметана за счет образования азеотроиа дихлормстан вода. После этого к сухому остатку добавляли смесь пиридина к бистримстнлсилилтрифторацстамида в отношении и нагревали раствор на масляной бане при 5 С в течение 4 часов. При этом, как указывает автор работы, для большинства аминокислот достаточным является время проведения реакции лпш9 тогда как для образования производных аргинина, лизина, гистидина, триптофана и цистина требуется длительный нагрев реакционной смеси.