Сравнительная ультраструктурная характеристика культур клеток, хронически инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота

• Автор: Вангели, Сергей Валерьевич
• Шифр специальности: 06.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 114 с. : ил.

2 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВЛ КРС - вирус лейкоза крупного рогатого скота
BLV - bovine leikemia virus
FLK-BLV - линия клеток почки эмбриона
инфицированная ВЛ КРС
ЛЭК-ВИЭВ-90 - линия клеток легкого эмбриона
инфицированная ВЛ КРС
ТЭК-МВА, 76 - линия клеток тимуса эмбриона
инфицированная ВЛ КРС
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК - рибонуклеиновая кислота
HTLV - вирус Т-клсточной лейкемии человека
РИД - реакция иммунодиффузии
ИФА - иммуноферментный анализ
ПЦР - полимеразная цепная реакция
мл - миллилитр
мкл - микролитр
нм -нанометр
н. - нуклеотид
а.о. - аминокислотный остаток
хронически
хронически
хронически

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Общая характеристика лейкоза крупного рогатого скота
2.2. Таксономия семейства ретровирусов
2.3. Вирус лейкоза крупного рогатого скота
2.3.1. Морфология В Л КРС
2.3.2. Структура генома ВЛ КРС 1В
2.3.3. Репликация вируса
2.4. Взаимодействие вирус-клетка
2.5. Культивирование вируса лейкоза крупного рогатого скота
2.6. Диагностика лейкоза крупного рогатого скота
2.6.1. Клинические, патоморфологические и гематологические методы исследования лейкоза КРС
2.6.2. Серологические реакции
2.6.3. Методы молекулярной диагностики
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Материалы и методы исследований
3.1.1. Культуры клеток
3.1.2. Культивирование перевиваемых линий клеток ЛЭК-ВИЭВ-90 и ТЬК-ВБУ
3.1.3. Определение индекса пролиферации и жизнеспособности клеток
3.1.4. Метод цитогенетического анализа
3.1.5. Метод оценки продукции антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота клетками изучаемых культур
3.1.6. Электронная микроскопия
3.1.7. Методики постановки ПЦР для выявления геномов вирусов
лейкоза и диареи КРС
3.2. Результаты исследований

3.2.1. Культурально-морфологические свойства культуры клеток ЛЭК-ВИЭВ-90
3.2.2. Культурально-морфологические свойства культуры клеток РЬК-

3.2.3. Цитогенетические исследования перевиваемых культур клеток ЛЭК-ВИЭВ-90 и РЬК-ВЬУ
3.2.4. Определение наличия антигена и генома в изучаемых культурах клеток ЛЭК-ВИЭВ и РЬК-ВЬУ
3.2.5. Электронно-микроскопическая характеристика перевиваемых культур клеток ЛЭК-ВИЭВ-90 и РЬК-ВЬУ
3.2.6. Морфология и пути морфогенеза вируса лейкоза крупного
рогатого скота в культурах ЛЭК-ВИЭВ-90 и РЬК-ВЬУ
3.2.7. Определение наличия генома вируса диареи КРС методом ПЦР в культурах клеток ЛЭК-ВИЭВ-90 и РЬК-ВЬУ
3.3. Обсуждение полученных результатов
4. ВЫВОДЫ
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
6. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

пипетированием и отбирали 1 мл суспензии для подсчета клеток.
Отделенные от стекла и суспендированные клетки подсчитывали в камере Горяева по общепринятой методике.
Для культивирования использовали среды Игла МЕМ или Игла ДМЕМ с добавлением 10% сыворотки эмбриона коровы, пеницилина-100 ед/мл, стрептомицина-100 мкг/мл. Клетки культивировали 7- суток в термостате при температуре 37°С, ежедневно наблюдая за ростом под микроскопом с увеличением 7x10. На 7 сутки сливали культуральную жидкость для получения антигена и проводили следующий пассаж по выше описанной методике.
3.1.3. Определение индекса пролиферации и жизнеспособности клеток
Индекс пролиферации - отношение выросших клеток к числу засеянных.
ИП = х : у,
где х — общее количество выросших клеток у - общее количество засеянных клеток
Светооптическое изучение культур проводили на нативных препаратах и специально выращенных на покровных стеклах фиксированных и окрашенных гематоксилин-эозином клетках.
3.1.4. Метод цитогенетического анализа
Приготовление препаратов хромосом проводили по методу Мурхеда (1960), который предусматривает накопление в культуре клеток с помощью колхицина метафазных пластинок, обработку клеток гипотоническим раствором, фиксацию препаратов и их окрашивание.
За 4-6 часов до окончания культивирования в культуральный флакон вносили колхицин в дозе от 0,3 до 1 мкг/мл в зависимости от типа культуры. Через указанное время питательную среду сливали, а на монослой клеток наслаивали теплый раствор (38°С), состоящий из 0,25%-ного трипсина и 0,2%-ного раствора Версена в соотношении 9:1. Через 5-10 минут, когда клетки начинали отслаиваться от стекла, раствор Версена с трипсином удаляли, а клетки