Усовершенствование лабораторной диагностики хламидийных инфекций свиней

• Автор: Сапегин, Виктор Михайлович
• Шифр специальности: 06.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Белгород
• Количество страниц: 160 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика хламидий

1.1.1. Систематика хламидий

1.1.2. Патогенность возбудителей хламидиозов свиней

1.1.3. Распространенность хламидиозов свиней

1.2. Диагностическая ценность лабораторных методов выявления и типирования возбудителей хламидиозов свиней

1.2.1. Немолекулярные методы

1.2.2. Молекулярно-генетические методы

1.3. Общие правила подбора праймеров

1.3.1. Выбор гена-мишени
1.3.2. Дизайн праймеров
1.3.3. Вырожденные праймеры
1.4. Факторы, воздействующие на амплификацию
1.4.1. Температура и время денатурации
1.4.2. Температура и время элонгации
1.4.3. Реакционная смесь
1.4.4. Ингибирование ПЦР
1.4.5. Количество циклов амплификации
1.4.6. «Горячий старт» ПЦР
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Эпизоотологическое обследование
2.2. Подбор методов выделения ДНК хламидий из клинического и патологического материала, а также из культур
2.2.1. Методы выделения ДНК
2.2.2. Сравнение эффективности выделения ДНК разными методами
2.2.3. Определение концентрации ДНК
2.3. Методика проведения электрофореза в агарозном геле

2.4. Разработка праймеров и схемы амплификации
2.5. Методика проведения амплификации
2.5.1. Состав реакционной смеси
2.5.2. Режимы амплификации
2.5.3. Контроли ПЦР
2.5.4. «Горячий старт»
2.6. Схема опыта по изучению чувствительности и специфичности ПЦР-тест-систем
2.7. Схема опыта по выявлению инфицированных животных с использованием ИФА-тест-систем и разработанной ПЦР-тест-системы
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Распространенность хламидиозов свиней в Белгородской области.
3.2. Сравнение эффективности методов выделения ДНК
3.3. Разработка схемы ПЦР-амплификации
3.4. Разработка праймеров
3.5. Оптимизация условий амплификации
3.5.1. Разработка режимов амплификации
3.5.2. Подбор оптимальной концентрации праймеров
3.5.3. «Горячий старт»
3.6. Изучение чувствительности и специфичности разработанной ПЦР-тест-системы
3.7. Сравнение чувствительности и специфичности разработанной ПЦР-тест-системы с коммерчески доступными аналогами
3.8. Изучение возможностей ИФА- и ПЦР-тест-систем по выявлению животных, инфицированных возбудителями хламидийных инфекций
ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ

GenBank

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
— American Type Culture Collection (Американская коллекция типовых культур)
— база данных нуклеотидных последовательностей Национального института здоровья США (National Institutes of Health, NIH)
— European Molecular Biology Laboratory — Европейская молекулярно-биологическая лаборатория (база данных нуклеотидных последовательностей Европейского института биоинформатики (European Bioinformatics Institute, или EBI))
— DNA Data Bank of Japan (база данных нуклеотидных последовательностей Национального института генетики Японии)
— inclusion forming unit (единица, формирующая хламидийное включение)
— main outer membrane protein (главный белок наружной мембраны)
— дезоксирибонуклеиновая кислота
— иммуноферментный анализ
— куриные эмбрионы
— липополисахарид
— микроиммунофлуоресценция
— пара нуклеотидов
— прямая иммунофлюоресценция
— полимеразная цепная реакция
— реакция иммунофлуоресценции
— рибосомальная РНК
— реакция связывания комплемента
— ретикулярное тельце

недостаточная стандартизация используемых реагентов и диагностических критериев.
Современные методы ИФА лишены этих недостатков. ИФА позволяет значительно повысить производительность и объективность анализа титров антител за счет автоматизации и применения фотометрии для детектирования результатов хромогенной реакции в микропланшетном формате. В ходе реакции происходит последовательное связывание с иммобилизованным на поверхности лунок антигеном, иммуноглобулинов сыворотки и специфичных к ним антител, конъюгированных с ферментом. Таким образом, уровень иммуноглобулинов в исследуемой сыворотке может быть определен количественно или полуколичественно по степени выраженности цветной реакции, катализируемой ферментом. Не менее важным преимуществом ИФА, которое обеспечивает высокую специфичность анализа, является возможность использования высокоочищенных рекомбинантных антигенов, например, фрагментов МОМР, ОМР-2 или ЛПС. Проведенные сравнительные исследования показали, что чувствительность и специфичность у рекомбинантного ИФА выше, чем у иммуноблоттинга, конкурентоспособного и косвенного ИФА [272].
Тем не менее, специфичность ИФА не является полной. Зарубежными исследователями было установлено, что антитела к хламидиям Ср. pneumoniae и
С. trachomatis обладают перекрестными реакциями в связи с тем, что эти антитела очень похожи [163]. Последующие исследования [59; 143] подтвердили четкую корреляцию между титрами антител к урогенитальным (С. trachomatis) и респираторным хламидиям (Ср. pneumoniae). Исследованиями других авторов было установлено, что антитела к С. trachomatis и C. suis одинаковы.
ИФА позволяет определить динамику развития инфекционного процесса, что косвенно свидетельствует об эффективности лечения.
IgM образуются в начале иммунного ответа на первичное внедрение возбудителя болезни, в том числе и хламидий. IgM синтезируются плазматическими клетками и составляют 5-10% от общего количества иммуноглобулинов в сыворотке крови. Данные антитела в сыворотке крови