Усовершенствование методов выделения и идентификации Listeria monocytogenes

• Автор: Пискунов, Антон Валерьевич
• Шифр специальности: 06.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Владимир
• Количество страниц: 136 с. : ил.

Оглавление
Введение

1. Обзор литературы

1.1. Экология листерий

1.2. Распространение в природе

1.3. Листериоз как пищевая токсикоинфекция

1.4. Таксономия листерий

1.5. Культурально-морфологические свойства Т. monocytogenes

1.6. Биохимические свойства листерий

1.7. Антигенная структура листерий

1.8. Патогенность листерий
1.9. Факторы патогенности листерий
1.10. Усовершенствованные и «быстрые» методы выделения и идентификации листерий
1.11. Использование ПЦР в диагностике листериоза
1.12. Масс-спектрометрия как метод идентификации микроорганизмов
1.13. Заключение по обзору литературы
2. Собственные исследования
2.1. Материалы
2.1.1. Культуры (штаммы и изоляты) микроорганизмов
2.1.2. Питательные среды
2.1.3. Растворы и химреактивы
2.1.4. Краски для микроскопических исследований
2.1.5. Оборудование
2.1.6. Животные
2.2. Методы
2.2.1. Получение бактериальной массы
2.2.2. Методы определения культурально-морфологических свойств
2.2.3. Методы определения биохимических свойств
2.2.4. Определение концентрации живых микробных клеток
2.2.5. Методы определения чувствительности к антимикробным препаратам
2.2.6. Определение гемолитической и фосфолипазной активности
2.2.7. Определение патогенности штаммов и изолятов
2.2.8. Идентификация листерий в ПЦР-РВ
2.2.9. Идентификация листерий на масс-спектрометре MALDI
3. Результаты собственных исследований
3.1. Получение штаммов и изолятов листерий
3.2. Определение биологических свойств культур (штаммов и изолятов)
L. monocytogenes и L. innocua
3.2.1. Тинкториальные свойства
3.2.2. Морфология колоний
3.2.3. Культуральные свойства листерий и определение подвижности
3.2.4. Биохимические свойства
3.2.5. Гемолитическая активность
3.2.6. Фосфолипазная активность
3.2.7. Патогенные свойства
3.2.8. Изучение чувствительности к антибактериальным препаратам
3.3. Оптимизация ПЦР-РВ для идентификации L. monocytogenes
3.4. Усовершенствование идентификации L. monocytogenes масс-спектрометрическим методом
4. Обсуждение результатов
5. Выводы
6. Практические предложения
7. Список литературы
8. Список сокращений
9. Приложения

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы.
Listeria monocytogenes является причиной возникновения листериоза у животных и человека. В настоящее время данное заболевание все чаще регистрируется в виде пищевой токсикоинфекции. Это обусловлено повсеместным распространением листерий в природе, полиморфизмом клинических признаков болезни, высоким уровнем летальности при генерализированных формах инфекции, возрастающими объемами оборота кормов и пищевых продуктов (в частности продуктов быстрого питания). Учитывая способность листерий размножаться в готовых к употреблению пищевых продуктах, хранящихся в холодильниках при низких температурах (при +4°С), перерабатывающая и пищевая промышленность вынуждена расходовать огромные средства для предотвращения выпуска контаминированной продукции [19, 64].
Роль эпидемических вспышек возрастает в связи с потреблением пищевых продуктов, так 28 сентября 2011 г. произошла крупная вспышка пищевого листериоза в США, при которой было госпитализировано 90 человек, 13 человек погибло, источником заражения были дыни. 22 ноября 2012 года в 13 штатах и в округе Колумбия при вспышке пищевого листериоза заболело 20 человек, 4 из которых скончались. Источником заражения явился сыр «Рикотта», поступивший из Италии [110]. Снижение резистентности макроорганизма увеличивает риск возникновения пищевого листериоза [117, 163, 167].
Листериоз протекает наиболее тяжело у людей с первичными и вторичными иммунодефицитами, т.е. у беременных и новорожденных, пожилых людей, лиц, получающих стероидные препараты, иммунодепрессанты, злоупотребляющих алкоголем и наркотиками, ВИЧ-инфицированных [170, 217].
Работы по изучению листерий показывают, что L. monocytogenes адаптируется к факторам окружающей среды, особенно под воздействием

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа выполнена в референтной лаборатории болезней крупного рогатого скота, ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»).
2Л. Материалы 2.1Л. Культуры (штаммы и изоляты) микроорганизмов
В работе использовали:
- референтные штаммы: Е. coli штамм №338, Bacillus subtilis штамм №6633, Staphylococcus aureus штамм №6538 (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), Salmonella dublin штамм №373 (ФГБУ «ВГНКИ»)
- 24 штамма Г. monocytogenes: «СЭС-33», «рыба №6», «К-4», «1 кр 1 1», «1кр23», «1кр12», «1кр22», «1кр24», «1 кр 14», «СЭС-36», «СЭС-37», «1кр6», «1кр9», «311», «1 кр 10», «СЭС-30», «243-09», «191», «1 кр 1», «1кр2», «1крЗ», «1кр4», «1кр5», «1кр7», «634»; 14 референтных штаммов L. monocytogenes: №15, №17, №5348, №57, №5214, №10528, №66, №10527, № 71, №10888, №74, №19118, №4883, №82; 3 изолята L, monocytogenes: «L-l», «L-2», «№608» (табл.З); 5 изолятов L. innocua: «1-1», «1228 (Р)», «1229 (F)», «1231 (М)», «1232» (табл. 3).
Все штаммы L. monocytogenes предоставлены ГНУ «ВНИИВВиМ», которые были выделены из различных объектов, в частности - объектов внешней среды, патологического материала от сельскохозяйственных и диких животных, рыбы, а также из кормов и пищевых продуктов.
Все перечисленные культуры хранили в лиофилизированном состоянии в музее бактериальных штаммов ФГБУ «ВНИИЗЖ» при температуре - 18-20°С. 2Л.2. Питательные среды
Для культивирования и изучения биологических свойств листерий использовали следующие ростовые среды:
- мясо-пептонный бульон (МПБ) [23];
- мясо-пептонный бульон (МПБ) с добавлением 1% глюкозы;
- мясо-пептонный агар (МПА);