Экспресс-метод диагностики метапневмовирусной инфекции птиц на основе иммуноферментного анализа

• Автор: Лисенкова, Анастасия Сергеевна
• Шифр специальности: 06.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 115 с. : ил.

Оглавление
1. Введение
2. Основная часть
2.1. Иммуноферментный анализ и его применение в ветеринарии
2.2. Метапневмовирусная инфекция птиц
2.2.1. Распространение и ущерб, причиняемый этой болезнью
2.2.2. Характеристика рода МЩарпеитоупиь семейства Рагатухоутбае
2.2.3.Эпизоотологические данные метапневмовирусной инфекции птиц
2.2.4. Клинические признаки и патологоанатомические изменения
2.2.5. Диагностика метапневмовирусной инфекции птиц
2.2.6. Профилактика метапневмовирусной инфекции птиц
2.3. Собственные исследования
2.3.1. Получение специфических компонентов для иммуноферментного анализа
2.3.1.1. Получение контрольного антигена метапневмовируса птиц
2.3.1.2. Получение специфической сыворотки к метапневмовирусу птиц
2.3.1.3.Выделение специфических иммуноглобулинов
2.3.1.4. Получение иммунопероксидазного конъюгата кур
2.3.2. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антигена метапневмовируса птиц
2.3.2.1. Определение оптимальных концентраций и условий взаимодействия компонентов
2.3.2.1.1. Определение сенсибилизирующих доз метапневмовирусных антител
2.3.2.1.2. Определение pH сорбирующего буфера
2.3.2.1.3. Определение времени и температуры сорбции антиметапневмовирусных антител
2.3.2.1.4. Определение времени и температуры инкубации антигенсодержащего материала с адсорбированными антиметапневмовирусными антителами
2.3.2.1.5. Определение специфичности иммуноферментного анализа
2.3.2.2. Оценка чувствительности иммуноферментной тест-системы
2.3.3. Практическое использование разработанного «сэндвич» варианта ИФА
2.3.3.1. Сравнительные исследования выявления антигена метапневмовируса птиц в клетках Уего «сэндвич» вариантом ИФА и методом титрации
2.3.3.2. Обнаружение антигена в клетках Уего и в органах цыплят, зараженных мтапневмовирусом птиц
2.3.3.3. Обнаружение антигена метапневмовируса птиц в патологическом
материале
3. Заключение
3.1. Выводы
3.2. Обсуждение результатов исследований
3.3. Практические предложения
Список сокращений
Список литературы
Приложения

1. Введение
Актуальность темы исследования. Болезнь, вызываемая метапневмовирусом птиц, зарегистрирована во многих регионах мира, как у индеек, так и у кур всех возрастов [6,21,148]. Первичная вирусная инфекция часто осложняется вторичной, бактериальной инфекцией, и заболевание протекает со сложной симптоматикой. Метапневмовирусная инфекция (МПВИ) птиц причиняет серьезный экономический ущерб из-за общего ослабления организма, спровоцированного поражением верхнего отдела респираторного тракта, и приводит к гибели, снижению мясной и яичной продуктивности взрослой птицы [91, 92]. Впрочем, этот вирус может быть вовлечен в мультифакторную болезнь, как, например, синдром большой головы, что крайне осложняет диагностику заболевания.
Многообразие подтипов А, В, С, Б возбудителя и вирулентных свойств метапневмовируса, также затрудняет правильную своевременную постановку диагноза и не позволяет дать оценку этиологической роли вируса в патогенезе и течении болезни [91].
Основными трудностями при выделении возбудителя является достаточно короткий период персистенции и ограниченный тропизм вируса в организме птицы [61, 145].
Поскольку клинические признаки болезни и патологоанатомические изменения при МПВИ птиц непатогномоничны, основная роль в постановке диагноза принадлежит лабораторным методам.
Степень разработанности темы исследования. Большинство методов, позволяющих выявить вирус в организме птицы, основано на иммуноферментном анализе [33,154].
Среди большого числа модификаций ИФА наибольшее распространение получил «сэндвич» вариант ИФА и ОТ-ПЦР для экспресс диагностики МПВИ [33]. Учитывая широкое распространение в Российской Федерации метапневмовируса птиц подтипов А и В и масштабное производство
Ряд авторов [60,96,163] отмечает контагиозность болезни, что подтверждено ими в опытах по контактному заражению птицы. Так, инфекционная природа МПВИ была установлена путем контакта от инфицированных птиц к восприимчивым индюшатам, от дикой птицы к индейке.
Основными источниками возбудителя болезни явились больная, павшая и переболевшая птица, корм, вода и воздух, инфицированные выделениями больной птицы. В стадах птиц болезнь распространяется быстро, и за 2-3 сут. птичник оказывается полностью инфицированным. Механическими переносчиками вируса могут быть обслуживающий персонал, инвентарь, транспорт, оборотная тара, помет, грызуны и кровососущие насекомые. Не исключается вертикальный путь передачи возбудителя через инкубационное яйцо [60].
Заражение МПВ птиц осуществляется воздушно-капельным, окулярным и интраназальным путями [130,131,170,194,206], при внутривенном инфицировании (через поврежденную кожу)[174,206]. У кур-несушек проявлялись клинические признаки (нервные явления, синдром SHS), похожие на некоторые из описанных у племенных кур в условиях полевой инфекции.
В условиях эксперимента, инфицированные индейки выделяли вирус в относительно короткие периоды времени, обычно с 3-4 до 9-10 сут. после инфекции, те. по большей части 6-7 сут. Кроме того, вирус является оболочечным РНК-содержащим и слабо устойчив вне хозяина. В виду этих фактов, столь быстрое его распространение по всей Англии и Уэльсу (бмес) в 1985 году Stuart et al. [218] предположили, что этот вирус мог быть занесен мигрирующими птицами и в процесс могут быть вовлечены грузовые автомобили, развозящие корма.
Относительно влияния сопутствующих респираторных патогенов на течение МПВИ птиц, таких как, Bordetella avium, Pasteurelia - подобные организмы [96], Mycoplasma gallisepticum [176] и E.coli [174], показано, что эти инфекционные агенты удлиняли и осложняли клиническое проявление и тяжесть течения болезни у индеек.