Безопасность, иммуногенность и профилактическая эффективность вакцинных штаммов вируса гриппа А/Н5N1 с удаленными факторами патогенности: белками NS1 и PB1-F2

• Автор: Романовская-Романько, Екатерина Андреевна
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 98 с. : 30 ил.

СОДЕРЖАНИЕ
1.ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 Вирусы гриппа A H5N1 - потенциальные возбудители пандемии.
2.1.1. Структура вируса гриппа A H5N1.
2.1.2. Особенности репродукции гриппа птиц A H5N1
2. 1.3. Эпидемиология вируса гриппа A H5N1. Угроза пандемии, вызванной вирусом гриппа A H5N1.
2.1.4. Иммунный ответ при гриппозной инфекции.
2.1.5. NS1 белок вируса гриппа: ингибитор врожденного и адаптивного иммунитета.
2.1.6. Белок PB1-F2. Новый фактор патогенности вируса гриппа 34 А.
2.1.7. Метод «обратной генетики» вируса гриппа.
2.2. Вакцинопрофилактика гриппа
2.2.1. Подготовка H5N1 кандидатов в вакцинные штаммы
2.2.2. Современные подходы к разработке H5N1 вакцин.
2.2.3. Разработка гриппозных вакцин с использованием методов обратной генетики.
2.2.4. Новый подход к созданию пандемической гриппозной вакцины. Живая гриппозная вакцина с удаленной генетической 52 последовательностью, кодирующей белок NS1 .
3.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1 Клеточные культуры.
3.2 Вирусы.
3.3 Вирусологические методы.
3.4 Лабораторные животные.
3.5 Иммунологические методы.
3.6 Молекулярно-генетические методы.
3.7 Методы статистической обработки данных.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
4.1 Получение и характеристика реассортантных H5N1 delNSl кандидатов в вакцинные штаммы.
4.1.1 Получение реассортантных H5N1 delNSl штаммов.
4.1.2 Рост H5N1 delNSl штаммов на культуре клеток Ver о.
4.2 Безопасность и профилактическая эффективность H5N1 delNSl кандидатов в вакцинные штаммы при применении у мышей.
4.2.1 Выделение H5N1 delNSl штаммов из респираторного
тракта и трансмиссия в другие органы.
4.2.2 Динамика изменения массы тела мышей, иммунизированных H5N1 delNSl штаммами.
4.2.3 Формирование крое с-реактивной защиты у мышей,
иммунизированных кандидатом в вакцинные штаммы УИ1203йе1Ж1.
4.2.4 Иммуногенность кандидата в вакцинные штаммы УЛ1203с1еШ81 на мышиной модели.
4.2.5 Профилактический эффект иммунизации кандидатом в вакцинные штаммы УМ1203<Те1М81 при гриппозной инфекции у мышей.
4.3 Безопасность и профилактическая эффективность кандидата в вакцинные штаммы УШ203с1еП[81 на модели яванских макак.
4.3.1 Развитие клинических симптомов у макак, иммунизированных штаммом УЛ1203с1е1Ы81.
4.3.2 Выделение штамма УЛ1203с1е1Л81 из респираторного тракта вакцинированных животных. Трансмиссия в другие органы.
4.3.3 Иммуногенность штамма УЫ1203Ве1И81 на модели яванских макак.
4.3.4 Протективная эффективность штамма УМ1203с1е1П81 на модели яванских макак.
4.4 Влияние отсутствия эксперессии белка РВ1-Б2 на характеристики Н5К1 с1еГ№51 вакцинного штамма.
4.4.1 Влияние отсутствия экспрессии белка РВ1-Р2 на вирулентность Н5Л1 реассортантного вирусного штамма.
4.4.2 Влияние отсутствия экспрессии белка РВ1-Р2 на способность Н5Л1 реассортантного вирусного штамма, вызывать летальную инфекцию у мышей.
4.4.3 Влияние отсутствия экспрессии белка РВ1-Р2 на ростовые характеристики Н5Л1 ВеШБ! штаммов на культуре клеток Уего
4.4.4 Влияние отсутствия экспрессии белка РВ1-Р2 на иммуногенность Н5Ы1 <4еШ81 штаммов.
4.5.4.Влияние отсутствия экспрессии белка РВ1-Р2 на профилактическую эффективность Н5Л1 с!е1М81 штаммов.
5. ОБСУЖДЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
В Оптическая плотность
НА Г емагглютинин
мої Множественность инфекции
ИА Нейраминидаза
ИОУ Вирус болезни Ньюкасла
а.к. Аминокислота
АПК Антигенпрезентирующие клетки
ВОЗ Всемирная Организация Здравоохранения
вРНК Вирусная РНК
ДК Дендритная клетка
ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота
днРНК Двунитевая РНК
ЖВГ Живая гриппозная вакцина
ивг Инактивированная гриппозная вакцина
ил Интерлейкин
ИНФ Интерферон
ИФА Иммуноферментный анализ
кРНК Комплементарная РНК
мРНК Матричная РНК
мяРНК Малая ядерная РНК
НК Натуральный киллер
онРНК Однонитевая РНК
ОРС Открытая рамка считывания
ОТ-ПЦР Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
п.о. Пара оснований
Пре-мРНК Предшественник мРНК
РКЭ Развивающиеся куриные эмбрионы
РМН Реакция микронейтрализации
РНК Рибонуклеиновая кислота
РНП Рибонуклеопротеин
РТГА Реакция торможения гемагглютинации
ТИД50 Тканевая инфекционная доза 50%
ТМБ Тетраметилбензидин
Тх Т-хелпер
ФБР Фосфатно-буферный раствор
ФНО Фактор некроза опухоли
ЭИДзо Эмбриональная инфекционная доза 50%
ЭЛДзо Эмбриональная летальная доза 50%
ЭФ Электрофорез

рамке считывания, это может привести к формированию новых полипептидов (Coleman, 2007) (Рис.6).
I—► РВ
1 CCG АСС ТТЛ СП ТТ< ТТЛ ллл GTG CCA JCA САА АА1 G
1MDVNPTLLFLKVPAQNAIST 2 Г)
1WMS I R Р Y FS ♦ KCQH КМ I * AQ .
r-^ PB1-F
61 ACT ТТС ССТ TAT ACT GGA GAC ССТ ССТ TAG AGC <|?U_GGC АСА GGA АГА GGA ТАС А ’ ■ ATG

21TFPYTGDPpySHGTGTGyTM 40 21 L 3 L I I. ETLLTA 1MOQEQDTPW
121 GAT ACT ПТГ ЛАС AGC АСА CAT CAG ТАС ТСА GAA АЛС GGA АСА TGG АСА АСА ААС Л САА ВО

41 I. Т V N Р Т Н У Г К г; р w ". Г__~_
1 -I____ь_s I «_______»__1_S__I_2_*_5_5__________________В___с__в_fi__I_I__________*
181 ACT GGA GCA CCG САА CTC AAC CCG ATT GAT GGG CCA CTG CCA GAA GAC AAT GAA < A AC.T 2 4
61 T G A P Ц L К P I t. G P i. P К Г- 4 Г _ Й
61 Ji____1_5_____*_H__§_______2__S____к_H в в С__________Q___К______Т М____N__Q____V
241 GGT TAT GCC САА АСА GAT TGT GTA TTG GAG GCG АТС ССТ ТТС СТТ GAG GAA ТСС CAT ССТ
81GYAQT DCV LEAMA FLE Е SH V
V М * 1 К 6 t yyW fe W L i L--P-N ~ P I L
301 GGT ATT TTT GAA AAc TCG TGI ATT GAA ACG ATG GAG GTT GTT 'A( САА АСА GA СТА AC JbO
101 G 1 F F N :; С 1 E T M F V V '■j С 1 H V I/O
-V—КТКУЬКЙЧЖЬГ »»»«!
Рис. 6. Схематическое изображение специфических траискриптов РВ1 гена вируса гриппа (Mazur et al.} 2008). Инициирующие кодоны трансляции белков РВ1 и PB1-F2 показаны черными стрелками. Открытая рамка считывания белка PB1-F2 выделена рамкой.
Белок PB1-F2 является короткоживущим в цикле репликации, максимум его экспрессии наблюдается через 5 часов после инфицирования. Основным местом локализации этого белка являются внешняя и внутренняя мембраны митохондрий, куда белок встраивается благодаря основной амфипатичской спирали на С-концевом участке. Взаимодействуя с компонентами порового комплекса митохондрий ANT3 и VDAC1 белок PB1-F2 может играть роль в индукции митохондрия-опосредованного апоптоза, путем формирования неспецифических пор в липидном бислое мембран (Zamarin et al., 2005). Было показано, что РВ1-F2 не индуцирует апоптоз сам по себе, но усиливает апоптоз в ответ на цитотоксические стимулы (Yamada et al., 2004; Zamarin et al., 2005).
Кроме типичной локализации PB1-F2 в мембране митохондрий, этот белок также выявляется в цитоплазме и ядре инфицированных клеток (Chen et al., 2001; Yamada et al., 2004). Различная локализация позволяет предположить, что белок может иметь различные функции. Белок PB1-F2 колокализуется и прямо взаимодействует с вирусной полимеразой РВ1, а недостаток PB1-F2 во время инфекции приводит к изменению локализации РВ1 и снижению полимеразной вирусной активности. Таким образом, PB1-F2 является