Разработка методов количественного определения вакцинных штаммов вирусов кори, эпидемического паротита и краснухи на основе ПЦР с детекцией в режиме реального времени

• Автор: Аммур, Юлия Игоревна
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 149 с. : ил.

Содержание
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Молекулярно-биологическая характеристика вирусов кори, эпидемического паротита и краснухи (КПК)
1.1.1. Семейство Рагатухоуігісіае. Вирусы кори и эпидемического паротита
1.2.2. Семейство Togaviridae. Вирус краснухи
1.1.3. Вакцинопрофилактика заболеваний, вызванных вирусами КПК
1.1.3.1. Вакцинные штаммы вируса кори
1.1.3.2. Вакцинные штаммы вируса эпидемического паротита
1.1.3.3. Вакцинные штаммы вируса краснухи
1.1.4. Традиционные методы количественной оценки вирусов
1.2. Молекулярные методы количественного определения вирусных нуклеиновых кислот
1.2.1. Общие принципы полимеразной цепной реакции
1.2.2. Реакция обратной транскрипции с последующей ПЦР (ОТ-ПЦР)
1.2.3. ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ)
1.2.4. Количественная ПЦР с детекцией в режиме реального времени (кПЦР-РВ)
1.2.5. Количественная оценка вирусов методом ПЦР-РВ, интегрированным с культуральным методом (ИКМ-ПЦР)
1.2.6. Мультиплексная ПЦР
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.1.1. Вирусный материал
2.1.2. Культуры клеток
2.1.3. Реактивы
2.2. Методы
2.2.1. Культивирование клеточных линий и вирусов
2.2.2. Определение титра вирусов КПК по ЦПД
2.2.3. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
2.2.4. Клонирование ПЦР-продуктов в плазмидном векторе
2.2.5. Определение тнтра вирусов КПК по содержанию вирусной РНК методом количественной ПЦР-РВ
2.2.6. Выявление вирусов КПК методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени
2.2.7. Электрофорез ПЦР-продуктов в агарозном геле
2.2.8.Статистичсская обработка результатов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Получение вирусного материала и калибраторов
3.1.1. Получение вирусного материала при культивировании вакцинных штаммов вирусов кори (1.-16), эпидемического паротита (Ь-З) и краснухи (Vistar РА 27/3)
3.1.2. Получение образцов калибраторов вирусов КПК
3.2. Разработка методических приемов количественного определения вирусов КПК с помощью метода на основе ПЦР-РВ

3.2.1. Подбор праймеров и зондов для выявления вирусов КПК и анализ их специфичности
3.2.2. Отработка выделения вирусных РНК
3.2.3. Построение калибровочных кривых
3.2.4. Оптимизация условий определения титра вирусов КПК методом на оснве ПЦР-РВ
3.2.5. Чувствительность, линейность и эффективность метода оценки титра вирусов КПК
на основе ПЦР-РВ
3.2.6. Воспроизводимость метода количественного определения вирусов КПК на основе ПЦР-РВ
3.2.7. Оценка метода количественного определения вирусов КПК на основе ПЦР-РВ на контрольных вакцинных препаратах
3.3. Определение корреляции результатов определения титра вирусов КПК методом на основе ПЦР-РВ и по ЦПД
3.3.1. Зависимость корреляции значений титров, полученных методом на основе ПЦР-РВ и по ЦПД, от клеточного субстрата
3.3.1.1. Репродукция вируса краснухи в диплоидных и перевиваемых культурах клеток
3.3.1.2. Репликация вируса кори в диплоидных и перевиваемых культурах кпеток
3.3.2. Влияние множественности заражения культуры клеток вирусами КПК на корреляцию значений титров, полученных методом на основе ПЦР-РВ и по ЦПД
3.4. Оптимизация условий мультиплексной ПЦР для одновременного выявления вирусов КПК
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
БО - метод бляшкообразования
ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения
ВПК - внутренний положительный контроль
ДИ (DI) - диффектные интерфирирующие геномы
ДКЧ - диплоидные клетки человека
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
дНТФ - дезоксирибонуклеозидтрифосфат
Е - эффективность амплификации
ЕРБ - европейское региональное бюро
ИКМ-ПЦР - метод ПЦР-РВ, интегрированный с культуральным методом
ИФА - иммуноферментный анализ
кДНК - комплементарная ДНК
КПК - корь, эпидемический паротит и краснуха
кПЦР-РВ - количественная ПЦР с детекцией в режиме реального времени
КЭ - куриные эмбрионы
Л-16 — штамм Ленинград
Л-3 - штамм Ленинград
мРНК - матричная РНК
и.о. - нуклеиновое основание
НК - нуклеиновые кислоты
ОРС - трансляционная рамка считывания
ОТ - обратная транскрипция
ОТ-пПЦР (RT-nPCR) — гнездовая «nested»-niJP
ОТ-ПЦР - реакция обратной транскрипции с последующей ПЦР
п.н. - пара оснований
ПМС - почки новорожденных морских свинок
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ПЦР-РВ - ПЦР с детекцией в режиме реального времени
p.c. - реакционная смесь

Рис. 5. Слева — незараженные клетки линии Vero-SLAM (культура клеток Vero, стабильно экспрессирующая человеческие SLAM рецепторы). Справа — ЦПД вируса кори BLR/MV/016/04 в культуре клеток Vero-SLAM.
Так как рецепторы к вирусу ЭП экспрессируются повсеместно на клетках млекопитающих, вирус способен инфицировать большинство клеточных линий. Помимо широко использующейся лабораторной клеточной линии Vero, вирус ЭП также хорошо размножается на клетках HeLa (клетки карциномы шейки матки человека), СаСо-2 (клетки человеческой аденокарциномы), PLC/PRF/5 (клетки карциномы печени человека) [21], а также LUGH-1 (клетки сердец гвинейской свиньи) [76] и других.
Характерный для вируса ЭП ЦПЭ выявляется на пятые сутки после заражения и представляет собой образование гигантских многоядерных клеток - симпластов, включающих до 100 ядер, с последующей деструкцией монослоя и формированием крупных полостей типа «мыльных пузырей». Однако цитопатический эффект вируса ЭП может значительно варьировать в зависимости от изолятов и субстратов (Рис. 6) [21, 80, 121].
Вирус краснухи способен размножаться на многих клеточных культурах, но цитопатические изменения вызывает лишь в немногих, в частности в перевиваемых культурах клеток ВНК-21 (клетки почек новорожденных хомячков) (Рис. 7 А, В), SIRC (клетки роговицы эмбриона кролика) (Рис. 7 С, D), RC-IAL (клеток почек кролика Institute Adolfo Lutz) (Рис. 7 Е, F), RK-13 (Рис. 7 G, Н) [67, 120; 160, 180; 7]. Цитопатические изменения, вызываемые вирусом краснухи, различаются для различных штаммов вируса, а