Регуляция экспрессии гена аполипопротеина А-1 человека при действии фактора некроза опухоли альфа

• Автор: Могиленко, Денис Александрович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 106 с. : ил.

Список использованных сокращений

КП канонический промотор

ЛПВГ1 липопротеины высокой плотности

ЛПНП липопротеины низкой плотности

ЛПОНП липопротеины очень низкой плотности

ТИТ точка инициации транскрипции

АроА-1 apolipoprotein А-I, аполипопротеин A-I

ABCAl ATP-binding cassette transporter А1, кассетный транспортер связывающий АТФ А

EST expression sequence tag

НЕ hepatic enhancer, гепацитарныйэнхансер

HRE hormone responsive clement, гормон-регулируемый элемент

IL-10 interleukin-10, интерлейкин-
IL-1|3 intcrlcukin-ip, интерлейкин-ip
ICAM inter-cellular adhesion molecule
MCP-1 monocyte chemoattractive protein-1, белок привлекающий макрофаги-
LXR liver X receptor
MpCD methyl-p-cyclodextrin
PGE2 prostaglandin E2, простагландин E
PPAR peroxisome proliferator-activated receptor
RT-PCR reverse transcription - polymerase chain reaction
SAA сывороточный амилоид A
SR-BI scavenger receptor В-I, скэвенжер-рецептор B-I
TNFa tumour necrosis factor alpha, фактор некроза опухоли альфа
VC AM vascular cell adhesion molecule
HNF hepatic nuclear factor :
NFkB nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated В cells

1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2J Функции липопротешюв высокой плотности человека
2.2 Структура и функции аполипопротеина А-I человека
2.3. Организация кластера генов аполипопротеинов человека apoA-1/apoC-III/apoA-
IV/apoA-V
2.4. Регуляция экспрессии гена ароА-I человека
2.5 Регуляция экспрессии ароА-I при воспалении
2.6. Ядерные рецепторы: структура и функции
2.7. LXRs
2.8. PPARs
2.9. HNF4a
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Ингибиторы сигнальных киназ, синтетические лиганды ядерных рецепторов и
рекомбинантные белки
3.2. Антитела
3.3. Генетические конструкции
3.4. Клеточные культуры и трансфекция
3.5 Животные
3.6. (3-галактозидазный и люциферазный тесты
3.7. Обратная транскрипция
3.8. Полимеразная цепная реакция в реальном времени - RealTime-PCR
3.9. Иммунопреципитация хроматина (ChIP)
3.12. Иммуноферментный анализ (ELISA)
3.13. Вестерн-блоттинг
3.14. Иммуноцитохимия
3.15. Проточная цитофлуорометрия
3.16. Получение ядерных экстрактов, гель-ретардация и супер-шифт в геле
3.17. Статистический анализ
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
4.1. TNFcc угнетает активность 5’-регуляторной области гена ароА-1 человека в клетках

4.2. NFkB и МАР -киназы участвуют в TNFa-зависимом угнетении экспрессии гена
ароА-I и секреции АроА-I в клетках HepG

4.3. Ядерный рецептор НЫР4а участвует в угнетении экспрессии гена ароА-1 человека в клетках Нер02 при действии ТОТа
4.4. Ядерные рецепторы РРАЯа и ЬХЯя участвуют в регуляции экспрессии гена ароА-1 человека и секреции АроА-1 в клетках НерС2 при действии ТЫ Ра
4.5. РРАЯу подавляет экспрессию гена ароА-1 и секрецию белка АроА-Г в клетках Нер02 [I принимает участие в ЮТа- зависимой регуляции экспрессии этого гена
4.6. РРАЯу подавляет транскрипцию гена ароЛ-1 через гепацитарный эпхансер в клетках Нер
4.7. ТИБа уменьшает количество РРАЛа и увеличивает количество ЬХРр, связанных с гепацитарным энхансером гена ароА-1 в клетках 1ТерС
4.8. РРАЛу взаимодействует с гепацитарным энхансером гена ароА-
4.9. ТЫРа подавляет экспрессию генов РЮТ4а, РРАЯа, ЬХЯа и ЬХПР в клет ках НерС
4.10. Влияние агониста и антагониста РРАЯу на взаимодействие РРАЯа и ЬХ1ф о гепацитарным энхансером гена ароА-
4.11. РРАЛу регулирует экспрессию НЯТ4а, РРАЯа, ЬХРа и Г.ХРр в клетках НерС2.
4.12. Эндогенный ген ароА-1 экспрессируется в моноцитах и макрофагах, полученных из мононуклеаров периферической крови человека, и в клетках моноцитарно-макрофагальной линии человека ТНР-
4.13. Экспрессия гена ароА-1, локализация и секреция белка АроА-1 в моноцитах и макрофагах ив клетках моноцитарно-макрофагальной линии человека ТНР-1
4.14. Роль ЫЕкВ, МАР-киназного сигнального каскада и ядерных рецепторов РРАРа и ЬХРд в ТЫРа-зависимой активации экспрессии гена ароА-1 в моноцитах и макрофагах ТНР-
4.15. Влияние ядерных рецепторов РРАРа и ЬХРх на содержание белка АроА-1 в моноцитах и макрофагах ТНР-
4.16. Влияние Т№'а па экспрессию генов РРАЯа, ЬХИа и ЬХК(( и на связывание ядерных рецепторов РРАЯа и ЬХПр с гепацитарным энхансером гена ароА-1 человека в моноцитах и макрофагах ТНР-
4.17. Взаимодействие РРАЯа и ЬХКР с НКЕ гепацитарного энхансера гена ароА-1 в макрофагах ТНР-
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
6. ВЫВОДЫ
7. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
пероксидазой хрена. Поликлональные кроличьи антитела против человеческого АроА-1 были описаны ранее (McVicar et al., 1984).
3.13. Вестерн-блоттинг
Клетки трижды отмывали PBS, затем лизировали в буфере RIPA-50 (50 мМ Tris-HCl,
150 мМ NaCl, 1% NP-40, 1 мМ EDTA, 0.1% SDS and 0.01% NaN3, 1 мМ PMSF, pH 7.4). SDS-элетрофорез белков проводили в 7% или 12% полиакриламидном геле. Вестерн-блоттинг проводили, как описано (Kim et al., 2009), используя систему детекции Enhansed Chemoluminiscence (ECL).
3.14. Иммуноцитохимия
Для иммуноцитохимического анализа экспрессии ApoA-I макрофаги ТНР-1 культивировали на пластиковых покровных стеклах (Tissue Culture Coverslips 13 mm. “Sarstedt”), а все манипуляции с моноцитами ТНР-1 проводили в суспензии. Кетки ТНР-1 фиксировали в 4% параформальдегиде на PBS в течение 20 мин при +4°С, трижды отмывали PBS. Для детекции внутриклеточного АроА-1 клетки пермеабилизировали добавлением 0.1% TritonX-100, 1% BSA на PBS в течение 20 мин при +22°С; в случае определения АроА-1, связанного с наружной поверхностью клеточной мембраны, пермеабилизацию не проводили. Далее препараты блокировали в течение 40 мин при +22°С в блокирующем буфере (1% BSA, 0.02% Tween-20, 1 мкг/мл неспецифических IgG человека на PBS). Клетки обрабатывали мышиными моноклональными антителами против АроА-1 человека в разведении 1:250 в 1% BSA; 0.02% Tween-20 на PBS при +37°С. 2 ч. После двукратной отмывки блокирующем буфером добавляли козьи поликлональные антитела меченые F1TC против .IgG мыши (Abeam, аЬ6669-1) в разведении 1:1000 в 1% BSA, 0.02% Tween-20 на PBS при +22°С 1 ч, трижды отмывали блокирующем буфером, один раз PBS и заключали в среду Vectashield (Vector Labs, USA), содержащую 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). В качестве контроля специфшчностн иммунного окрашивания использовали клетки, которые не обрабатывали антителами против АроА-1, но обрабатывали антителами, мечеными FITC. Клетки анализировали методом лазерной сканирующей конфокальной микроскопии при помощи Leika TCS SPE LCSM.
3.15. Проточная цитофлуорометрия
Моноциты и макрофаги TIIP-1 культивировали в 24-луночных планшетах, как описано
выше. Кетки ТНР-1 фиксировали в 4% параформальдегиде на PBS в течение 20 мин при +4°С. Макрофаги ТНР-1 аккуратно снимали с планшетов и проводили иммуноцитохимическую окраску на мембранный и внутриклеточный АроА-1 как описано выше. Анализ клеток проводили при помощи проточного цитофлуориметра Epic Altra