Белок KRP как ингибитор фосфорилирования миозина: участие в регуляции сокращения гладких мышц

• Автор: Щербакова, Ольга Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 130 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ:
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Основные принципы регуляции сокращения гладких мышц
1.1. Особенности структуры и регуляции гладкомышечного миозина
2. Механизмы регуляции фосфорилирования миозина
2.1. Киназа лёгких цепей миозина
2.1.1. Структура и свойства киназы лёгких цепей миозина
2.1.2. Регуляция киназы лёгких цепей миозина
2.2. Са2+-независимое фосфорилированне миозина
2.2.1. ZIP-киназа
2.2.2. ILK
2.3. Фосфатаза лёгких цепей миозина
2.3.1. Структура и свойства фосфатазы лёгких цепей миозина
2.3.2. Регуляция фосфатазы лёгких цепей миозина
3.KR P
3.1. Структура белка KRP и его свойства in vitro
3.2. Расслабление гладких мышц под действием KRP
3.3. Фосфорилированне KRP
4. Использование скицированных гладкомышечных волокон для исследования регуляции сократительной активности
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы
Методы
1. Молекулярно-биологические методы
1.1. Получение химически компетентных клеток E. coli
1.2. Трансформация бактериальных клеток
1.3. Выделение плазмидной ДНК из клеток E. coli
1.4. Бактериальная экспрессия рекомбинантных белков
2. Биохимические методы
2.1 Определение концентрации белков
2.2. Приготовление образцов тканей для электрофореза

2.3. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле (ПААГ) по методу Лэммли
2.4. Электрофоретическое разделение белков в ПААГ в присутствии мочевины и глицерина
2.5. Иммуноблоттинг
2.6. Выделение белков
2.6.1. Выделение тяжёлого меромиозина (НММ)
2.6.2. Выделение цГМФ-зависимой протеинкиназы (PKG)
2.6.3 Выделение рекомбинантного KRP человека (wt-hKRP и AC-hKRP)
2.6.4. Выделение рекомбинантного KRP курицы, содержащего С-концевой полигисгидин (chiKRP-His6, AN-chiKRP-His6 и AC-chiKRP-His6 )
2.6.5. Экспрессия и очистка GST-p44erkl МАР-киназы
2.7. Получение фрагмента КЛЦМ с массой 61 кДа
2.8. Фосфорилирование KRP in vitro и его очистка от протеинкиназ
2.9. Фосфорилирование НММ под действием КЛЦМ
3. Физиологические методы исследования
3.1. Получение препарата taenia coli, скинированного Тритоном Х-
3.2. Измерение сократительной активности taenia coli
3.3. Измерение фосфорилирования KRP в волокнах в ходе сокращения, индуцированного микроцистином
3.4. Измерение дефосфорилирования KRP в волокнах taenia coli
4. Конфокальная микроскопия волокон taenia coli
5. Статистический анализ
РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ
1. KRP ингибирует фосфорилирование НММ под действием киназы лёгких цепей миозина, лишённой KRP-домена
2. KRP тормозит развитие сокращения, индуцированного микроцистином
3. Фосфорилирование KRP под действием PKA/PKG и МАРК не влияет на его ингибиторный эффект
3.1. Фосфорилирование не влияет на ингибиторную активность KRP в условиях in vitro
3.2. Фосфорилирование не влияет на способность KRP ингибировать сокращение, индуцированное микроцистином
4. Влияние РКА и PKG на развитие сокращения, индуцированного микроцистином
4.1. РКА и PKG не влияют на сокращение, индуцированное микроцистином
4.2. Фосфорилированпый KRP не изменяет эффекта PKA/PKG на сокращение, индуцированное микроцистином
5. Фосфорилирование KRP под действием PKA/PKG и МАРК не влияет на его способность расслаблять гладкие мышцы, сокращённые при субмаксимальной концентрации кальция
5.1. РКА, но не PKG вызывает расслабление скицированных волокон, сокращенных при субмаксимальной концентрации кальция

5.2. KRP вызывает расслабление сокращённых при субмаксимальной концентрации кальция волокон, но действие KRP не зависит от его фосфорилнрования
5.3. PKG не усиливает действия KRP
5.4. KRP не усиливает действия РКА
6. Влияние KRP на сенситизацию Са2+-сокращения, вызванную ингибированием фосфатазы миозина
7. Удаление С-концевой последовательности KRP приводит к потере его регуляторного эффекта на сократительную активность мышц
7.1. С-концевая, но не N-концевая последовательность необходима для ингибиторного действия KRP in vitro
7.2. С-концевая последовательность необходима для ингибиторного действия KRP в модели сокращения, индуцированного микроцистином
7.3. ACKRP не вызывает расслабления гладкомышечных волокон, нредсокращенных под действием Са2+
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
1. Гипотетический механизм ингибирования фосфорилнрования РЛЦ миозина белком KRP
2. Роль KRP в регуляции сократительной активности гладких мышц....................1 Об
3. Эффект KRP не регулируется фосфорилированием
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

В экспериментах in vitro было показано, что KRP является своеобразным ингибитором реакции фосфорилирования РЛЦ киназой легких цепей миозина. Наблюдаемые кинетические параметры такие же, как при конкурентном типе ингибирования. Действительно в присутствии KRP Км реакции фосфорилирования для миозина увеличивается с 2,4 до 29 рМ (для НММ), a Vmax реакции при этом не изменяется (Silver et al., 1997). Тем не менее, ингибирование наблюдается, только если в качестве субстрата для киназы используется ннтактная молекула миозина, или тяжелый меромиозин (НММ) (Shirinsky et al., 1993), но не в том случае, когда в качестве субстрата используются изолированные РЛЦ (Collinge et al., 1992) или субфрагмент SI (Nieznanski and Sobieszek, 1997). Таким образом, для того, чтобы ингибировать КЛЦМ, KRP необходимо связаться с участком «шейки» миозина. Было предположено, что KRP конкурирует с KRP-доменом КЛЦМ за связывание с миозином (Shirinsky et al., 1993, Silver et al., 1997). Однако близость участка связывания KRP и РЛЦ позволяет предположить иной механизм, согласно которому KRP физически препятствует связыванию каталитического домена КЛЦМ с РЛЦ миозина. В этом случае KRP может оказаться более универсальным ингибитором фосфорилирования РЛЦ и ингибировать фосфорилирование РЛЦ не только под действием КЛЦМ, но и под действием неканонических протеинкиназ. Для уточнения механизма ингибирования фосфорилирования РЛЦ белком KRP, представляется необходимым проведение дополнительных исследований с использованием делеционных фрагментов KRP и КЛЦМ.
3.2. Расслабление гладких мышц под действием KRP
Специфическое подавление экспрессии KRP у мышей не явилось летальным. Однако гладкие мышцы мышей, не способных экспрессировать KRP, проявляли большую чувствительность к кальцию по сравнению с мышами дикого типа. Эти данные свидетельствуют о том, что KRP может участвовать в снижении Са2+ -чувствительности гладких мышц in vivo (Khromov et al., 2006). В экспериментах на изолированных гладкомышечных волокнах, обработанных тритоном Х-100, так называемых, скицированных волокнах (см. разд. 4), также было показано, что KRP снижает сократительную активность мышц. Добавление экзогенного KRP к скицированной мышце приводит к снижению уровня фосфорилирования РЛЦ и расслаблению мышцы при фиксированной концентрации ионов кальция (Wu et al., 1998, Walker et al., 2001, Sobieszek et al., 2005).