Поиск путей повышения эффективности противоопухолевых вакцин на основе модифицированных дендритных клеток

• Автор: Марков, Олег Владимирович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 156 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ ДЕНДРИТНЫМИ КЛЕТКАМИ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ИММУННОГО ОТВЕТА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
1.1. Основы функционирования ДК: связь ДК с врожденным и приобретенным типами иммунитета

1.2. Происхождение и субпопуляции ДК

1.2.1. Предшественники ДК (преДК)

1.2.2. Субпопуляции ДК

1.2.2.1. Плазмацитоидные ДК

1.2.2.2. Классические ДК

Классические ДК мыши

Классические ДК человека
1.3. Функции ДК
1.3.1. Презентация антигенов ДК с помощью молекул МНС II
1.3.2. Кросс-презентация АГ с помощью молекул МНС I
1.3.3. Процессинг АГ и образование комплексов с МНС
1.3.3.1. Вакуолярный путь процессинга АГ
1.3.3.2. Цитозольный путь процессинга АГ
1.3.4. Кросс-дрессинг ДК
1.3.5. Индукция функции кросс-презентации ДК
1.4. Уход опухоли от иммунного надзора путем подавления функций ДК
1.4.1. Опухолевая строма
1.4.2. Механизмы подавления опухолью функций ДК
1.4.2.1. Подавление опухолью миграции ДК
1.4.2.2 Роль воспаления в подавлении функции ДК и прогрессии опухоли
1.4.2.3. Роль экзосом, выделяемых опухолевыми клетками, в подавлении функций ДК
1.4.3. Роль опухолевого окружения в подавлении функций ДК
1.4.3.1. Цитокины и ростовые факторы при опухолевой прогрессии
1.4.3.2. Влияние гипоксии при опухолевой прогрессии на функции ДК
1.4.3.3. Влияние измененного метаболизма опухолевых клеток на функцию ДК
1.5. Инициация противоопухолевого ответа с помощью ДК, нагруженных ОАГ

1.5.1. Нагрузка ДК ОАГ и ко-стимулирующими молекулами или экспрессирующими
их конструкциями
1.5.1.1. Физические методы доставки АГ в ДК
1.5.1.2. Вирусные системы доставки АГ в ДК
1.5.1.3. Химические вектора для доставки АГ в ДК
1.5.1.4. Сигналы запуска противоопухолевого иммунного ответа
1.5.2. Применение ДК, нагруженных ОАГ, в терапии злокачественных
новообразований
1.5.2.1. Эффективность ДК вакцин на мышиных моделях опухолевой прогрессии in

1.5.2.2. Исследование способности ДК пациентов, страдающих опухолями
различного типа, активировать противоопухолевые Т-лимфоциты ex vivo
1.5.2.3. Эффективность ДК вакцин в клинических испытаниях
Заключение
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. МАТЕРИАЛЫ
2.1.1. Реактивы и препараты
2.1.2. Оборудование
2.1.3. Плазмиды
2.1.4. Буферы и растворы
2.1.5. Клеточные культуры
2.1.6. Лабораторные животные
2.1.7. Опухолевые модели
2.1.8. Липосомы
2.2 МЕТОДЫ
2.2.1. Гель-электрофорез
2.2.1.1. Электрофорез в агарозном геле
2.2.1.2.Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях
2.2.2. Получение первичных культур опухолевых клеток
2.2.3. Выделение суммарной клеточной РНК
2.2.4. Выделение предшественников ДК мыши из костного мозга
2.2.5. Получение незрелых ДК из костно-мозговых предшественников ДК
2.2.6. Получение первичной культуры спленоцитов из селезенки мыши
2.2.7. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток антителами
2.2.8. Приготовление комплексов катионных липосом и нуклеиновых кислот
2.2.9. Физико-химическая характеристика липосом и липоплексов
2.2.10. Агглютинация с конканавалином А
2.2.11. Трансфекция pEGFP, PHK-EGFP, РНК-Кребс-2, PHK-LLC и PFIK-B16 в предшественники ДК и незрелые ДК мыши
2.2.12. Проточная цитометрия
2.2.13. Получение лизата клеток Кребс-2 и В16 и нагрузка ДК
2.2.14. Трансплантация опухолей
2.2.15. Исследование in vivo противоопухолевой активности ДК, нагруженных РНК в комплексах с липосомами ex vivo
2.2.16. Измерение уровней цитокинов в культуральной среде и сыворотке крови экспериментальных животных
2.2.17. Определение цитотоксической активности Т-лимфоцитов in vitro методом МТТ-теста
2.2.18. Реакция аллогенных смешанных лимфоцитов
2.2.19. Праймирование Т-лимфоцитов in vivo с помощью маннозилированных липосом
2.2.20. Состав вакцин и схемы вакцинации мышей ДК
2.2.21. ОТ-ПЦР в режиме реального времени
2.2.22. Статистический анализ
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
3.1. Приготовление ДК вакцины
3.2. Определение способности ДК активировать противоопухолевые ответы ex vivo и in vivo
3.3. Исследование трансфекционной активности поликатионных липосом
3.3.1. Поликатионные липиды и липосомы
3.3.2. Доставка плазмидной ДНК в костно-мозговые предшественники ДК и незрелые ДК с помощью катионных липосом
3.3.3. Доставка PHK-EGFP в костно-мозговые предшественники ДК и незрелые ДК мыши с помощью катионных липосом
3.3.4. Исследование противоопухолевого потенциала ДК, трансфицированных опухолевой РНК с помощью катионных липосом ex vivo, на метастатической модели меланомы В16 мыши
3.3.5. Влияние липоплексов, содержащих РНК-В16, на иммуномодулирующие свойства ДК

ингибируют опухолеспецифические Т-лимфоциты. Более того, оба хемокина действуют непосредственно на опухолевые клетки и увеличивают их миграционный и инвазивный потенциал [108]. При хроническом воспалении наблюдают активацию клеточных онкогенов MYC, RAS, RET и BREF [107].
Известной чертой многих опухолевых клеток является гиперэкспрессия белка STAT3, запускаемая основными онкогенами и цитокинами. STAT3 активирует экспрессию нескольких иммуносупрессивных цитокинов, включая ИЛ-10 и ФРО-ß и супрессирует Thl ответ. Экспрессия STAT3 опухолевыми клетками вызывает продукцию STAT3 различными лейкоцитами, включая и ДК, взаимодействующие с опухолевыми клетками, и приводит к различным вредным последствиям. В частности, экспрессия STAT3 у опухолеспецифических ДК вызывает снижение экспрессии ко-стимулирующих молекул и МНС II молекул и активирует экспрессию ФРО-ß. Опухолевая прогрессия также коррелирует с накоплением незрелых ДК, которые индуцируют пролиферацию регуляторных Т-лимфоцитов (Трег клеток) в инфильтрованных опухолью лимфоузлах.
1.4.2.3. Роль экзосом, выделяемых опухолевыми клетками, в подавлении функций ДК
Опухолевые клетки способны секретировать микровезикулы, называемые экзосомами, с помощью которых злокачественные клетки способны оказывать разнообразные эффекты как на себя (аутокринно), так и на другие опухолевые клетки и клетки микроокружения опухоли (паракринно), и даже клетки других органов и тканей (эндокринно) [109]. Экзосомы представляют собой сферические или чашеобразные везикулы размером от 30 до 100 нм, экспрессирующие на своей поверхности специфические молекулярные маркеры (такие как тетраспанины CD9, CD81 и CD63; молекулы CD80, CD86, МНС I, МНС II и другие) [110]. Экзосомы опухолевых клеток являются одной из составляющих механизма подавления функции иммунных клеток и ухода от иммунного надзора.
Было обнаружено, что экзосомы опухолевых клеток способны подавлять иммунную систему с помощью нескольких механизмов, таких как, снижение количества и подавление функций ДК, ослабление пролиферации и цитотоксичности натуральных киллеров и Т-лимфоцитов, а также увеличение количества иммуносупрессивных клеток (MDSC и Т-регуляторных клеток) [109, 110].
При воздействии на ДК опухолевые экзосомы способствуют усилению фосфорилирования STAT3 и экспрессии ИЛ-6 ДК, таким образом, снижая как активность ДК, так и их количество путем ингибирования дифференцировки CD14+ моноцитов в