Регуляция ядерных рецепторов PPARα, -β, -γ при стимуляции системы врожденного иммунитета в условиях гипергликемии

• Автор: Чистяков, Дмитрий Викторович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 127 с. : ил.

Оглавление

Список сокращений

1. Введение

2.1. Врожденный иммунитет как защитная система организма

2.1.1. Воспаление как ответ системы врожденного иммунитета

2.1.2. Взаимосвязь воспаления и нарушений метаболизма

2.2.Толл-подобные рецепторы (ТЬЯ) как часть системы врожденного иммунитета на молекулярном уровне

2.2.1. Строение и локализация Толл-подобных рецепторов

2.2.2. Внутриклеточная сигнализация Толл-подобных рецепторов

2.2.3. Экзогенные и эндогенные лиганды толл-подобных рецепторов

2.2.4. Толл-подобные рецепторы в головном мозге

2.4. Ядерные рецепторы РРАЯ на перекрестке метаболических и регуляторных
сигнальных путей.
2.4.1. Структурные свойства РРАЯ и механизмы регуляции ими экспрессии генов
2.4.2. Экзогенные и эндогенные лиганды РРА11
2.4.3. Роль РРАЯ в регуляции генов липидного метаболизма
2.4.4. Регуляция РРАЯ на молекулярном уровне
2.5. Анализ подходов к изучению регуляции ядерных рецепторов РРАЯа, р, у при стимуляции системы врожденного иммунитета в условиях гипергликемии.
2.5.1. Клеточные модели гипергликемии
2.5.2. Астроциты как объект исследования врожденного иммунитета в центральной нервной системе
2.5.3. Изучение регуляции экспрессии генов с помощью ингибиторов белкового синтеза. Явление супериндукции.
2.5.4. Деградация мРНК как один из механизмов регуляции экспрессии
2.6. Постановка целей и задач исследования
3. Материалы и методы
3.1. Приборы
3.2. Реактивы и препараты
3.3. Выделение и культивирование клеточных линий
3.3.1. Первичные астроциты крысы
3.3.2. Клеточная культура НеЬа
3.3.3. Клеточная культура С6
3.3.4. Оценка пролиферации клеток
3.4. Выделение тотальной РНК
3.5. Определение экспрессии генов
3.6. Иммуноблотинг и электрофорез
3.7. Измерение концентрации простагландина (Рв) Е2
3.8. Измерение ДНК-связывающей активности РРА11
3.9. Статистический анализ

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Характеристика воспалительного процесса в условиях гипергликемии на клетках линии НеЬа.
4.1.1. Влияние ЬРБ на экспрессию генов СОХ-1 и СОХ-2 в клетках, культивируемых с высокой концентрацией глюкозы
4.1.2. Влияние росиглитазона на уровень экспрессии генов СОХ-1 и СОХ-
4.1.3. Влияние ЬРБ на уровень экспрессии генов РРАЛа, РРАЯр и РРАЯу
4.1.4. Влияние росиглитазона на уровень экспрессии генов РРАЯа, -р и -у.
4.2. Характеристика ТЬЯ-стимулированных ответов астроцитов в условиях
клеточной гипергликемии
4.2.1. Морфология и иммуноцитохимия по вБАР для астроцитов культивируемых при разной концентрации глюкозы.
4.2.2. Влияние глюкозы на выброс РйЕг и ТОТа в астроцитах при активации системы врожденного иммунитета.
4.2.3. Изменение экспрессии и ДНК-связывающей активности РРАЛа, -Р, -у при культивировании астроцитов в условиях гипергликемии.
4.2.4. Влияние глюкозы на экспрессию трех изоформ РРАЯ в условиях активации системы врожденного иммунитета.
4.2.5. Модуляция ЬРБ-стимулированного воспалительного ответа в астроцитах с помощью МАРК ингибиторов в условиях повышенной концентрации глюкозы в среде культивирования.
4.3. Исследование механизма регуляции ядерных рецепторов РРАЯ при активации ТЬ11 на астроцитах.
4.3.1. ТЫ1-агонисты подавляют уровень экспрессии PPAR.cc и РРАЯу, но увеличивают экспрессию РРАКр
4.3.2.Характеристика ЬРБ-стимулированной экспрессии мРНК и белка РРАНа, -Р, -у.
4.3.3. Скорость распада мРНК РРАЯа, -Р, -у. замедляется при активации ТЬК4.
4.3.4. Активация р38 и скорость деградации мРНК
4.3.5. Модуляция экспрессии и активности РРАКа, -р, -у различными ингибиторами МАРК
4.3.6. Роль р38 в регуляции экспрессии РРАЯа, -Р, -у.
4.3.7. Роль циклогексимида в регуляции экспрессии мРНК РРАЯа, -р, -у.
4.3.8. Регуляция СОХ-2 в астроцитах при стимуляции ТЬЯ
4.3.9. Обобщенная схема регуляции изоформ РРАЯ в ЬРЗ-стимулированных астроцитах.
5. Выводы
6. Список литературы
7. Благодарности

Список сокращений
LPS - Липополисахарид клеточной стенки бактерий
МАРК - митоген-активируемая протеинкиназа
ERK - киназа, регулируемая внеклеточными сигналами
JNK - c-Jun-N-терминальная киназа
FGL - флагеллин
PGN - пептидогликан
PPAR - рецеторы активаторов пролиферации пероксисом
TLR - Толл-подобный рецептор
PG - простагландин
TNFcc, - фактор некроза опухоли
IL - интерлейкин
DAMP - Молекулярный паттерн , ассоциированная с повреждениями РАМР - патоген-ассоциированный молекулярный паттерн GFAP - глиальный фибриллярный кислый белок СОХ - циклооксигеназа
2.5.3. Изучение регуляции экспрессии генов с помощью ингибиторов белкового синтеза. Явление супериндукции.
Такие ингибиторы белкового синтеза как циклогексимид и анизомицин широко применяются в молекулярно-биологических исследованиях для определения, нужен ли de novo синтезированный белок для тех или иных биологических процессов [49]. Анизомицин и циклогексимид действуют схожим образом и связываются с Е-сайтом рибосомы, блокируя фазу элонгации [40]. Таким образом, если какой-либо клеточный ответ меняется после обработки ингибитором, то предполагается, что в реализацию данного клеточного ответа вовлекается синтез белка. Если изучают сигнальные каскады, то предполагают, что существует короткоживущий белок (живущий меньше, чем время изучения каскада), который вовлечен в регуляцию сигнального пути.
На целом ряде клеточных линий (см. Таблицу 2.2.) показано, что добавление к клеткам ингибиторов белкового синтеза приводит к накоплению специфических генных транскриптов. Этот феномен назвали «генная супериндукция» [71, 127]. Интерес к нему вызван и тем фактом, что указанные ингибиторы белкового синтеза широко применяют в опытах in vivo при исследовании процессов формирования памяти в мозгу, где применение этих ингибиторов вызывает амнезию [43].