Получение рекомбинантных белков-киллеров патологических В-клеток

• Автор: Степанов, Алексей Вячеславович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 106 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Рассеянный склероз

ОСНОВНЫЙ БЕЛОК МИЕЛИНА

Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит

Роль Т-КЛЕТОК В РАЗВИТИИ И ПАТОЛОГИИ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО АУТОИММУННОГО

ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТА

РОЛЬ В-КЛЕТОК В РАЗВИТИИ И ПАТОЛОГИИ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО АУТОИММУННОГО

ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТА

СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ТЕРАПИИ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА
Иммуномодулирующие препараты для терапии PC
Моноклональные антитела в терапии PC
Иммунотоксины в терапии рассеянного склероза и аутоиммунных заболеваний
Антиген-специфическая терапия рассеянного склероза
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Химические реактивы и сопутствующие материалы
Работа с нуклеиновыми кислотами
Работа с эукариотическими клетками
Методы работы с бактериями Е.сои
Хроматографические процедуры
Работа с белками
Работа с животными
Пациенты с рассеянным склерозом
Приготовление липосом
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Сравнительный анализ иммунодоминантных фрагментов ОБМ при рассеянном склерозе и
экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите
Терапия экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита фрагментами ОБМ,
инкапсулированными в липосомы
Создание липосом, содержащих инкапсулированные фрагменты ОБМ
Антиген-специфичная иммуномодулирующая терапия ЕАЕу крыс линии DA пептидами ОБМ,
инкапсулированными в липосомы
Направленная элиминация В-клеток белками-киллерами
Создание генетических конструкций рекомбинантных белков-киллеров
Экспрессия и очистка рекомбинантных белков-киллеров
Анализ функциональной активности полученных белков-киллеров
Исследование цитотоксических свойств белков-киллеров ex vivo
Селективная элиминация целевых В-клеток в культуре спленоцитов
Элиминация аутореактивных В-клеток in vivo
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
Ат - антитело
АПК - антигенпредставляющая клетка
ГКГС (МНС) - главный комплекс гистосовместимости
ДМСО - диметилсульфоксид
ДСН - додецилсульфат натрия
ЕАЕ - экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит
ЕТА - псевдомонадный токсин
ИЛ - интерлейкин
ИФНб - интерферон-бета
ИПЛ - измененные пептидные лиганды
ИТ - иммунотоксин
кДа - килодальтон
МОГ - миелин-олигодендроцитарный гликопротеин
монАт - моноклональное антитело
НФГМ - нейротрофический фактор головного мозга
ОБМ (МБР) - основный белок миелина
ПААГ - полиакриламидный гель
ПАФ - полный адъювант Фрейнда
НАФ - неполный адъювант Фрейнда
ПЦР - полимеразная цепная реакция
PC - рассеянный склероз
РИБ - рибосом-инактивирующие белки
СКВ - системная красная волчанка
ФЭ-2 - фактор элонгации
ФИТЦ - флуоресцеин-5-изотиоцианат
ШИТ - шига-подобный токсин E.coli
IgG - иммуноглобулины класса G
PLP - протеолипидный белок
SUV - однослойные липосомы
TGF - трансформирующий фактор роста
Тх - Т-хелперы
Tr, Treg - Т-регуляторные клетки
ВВЕДЕНИЕ.
Рассеянный склероз (РС) - это хроническое воспалительное нейродегенеративное заболевание аутоиммунной природы с неизвестной этиологией. Патогенез данного заболевания включает в себя повреждение миелиновой оболочки нервных волокон, что приводит к постепенной утрате различных функций центральной нервной системы, связанных с физическим и психоэмоциональным состоянием больного. Более миллиона человек болеет рассеянным склерозом во всем мире. Основную роль в патологическом процессе демиелинизации аксонов отводят Т- и В-клеткам, специфичным к компонентам миелиновой мембраны. Список потенциальных аутоантигенов постоянно расширяется и включает в себя различные белки ассоциированные с мембраной олигодендроцитов. Среди них особо выделяют основный белок миелина (ОБМ) и миелин олигодендрацитарный гликопротеин (МОГ). Аутореактивные лимфоциты, специфичные к данным белкам, совместно с макрофагами проникают через гематоэнцефалический барьер и индуцируют процессы воспалительной демиелинизации в ЦНС. Известно, что Т-клетки ответственны за острый иммунный ответ по отношению к олигодендроцитам, в то время как В-клетки продуцируют патогенные аутоантитела и являются активными антигенпредставляющими (АПК) и цитокинпродуцирующими клетками. Ещё одним подтверждением важности В-ютеток при патологии РС является наличие каталитических антител к ОБМ в сыворотке больных, которые могут не только связывать ОБМ, но и гидролизовать его.
Современное понимание особенностей механизмов индукции и патогенеза заболевания значительно изменили взгляды на терапию РС. На сегодняшний день существует несколько подходов к лечению данного заболевания: А) Введение так называемых “измененных пептидных лигандов” (ИПЛ), взаимодействующих с Т-клеточными рецепторами (ТкР). ИПЛ являются модифицированными, мутированными или укороченными участками последовательностей, связывающихся с ТкР. ИПЛ могут частично активировать Т-клетки, переключая их

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Химические реактивы и сопутствующие материалы.
В работе использовали следующие реактивы и материалы;
Реактивы: трис-гидроксиметиламинометан (трис), персульфат аммония, тетраборат натрия, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), одно- и двузамещенный фосфат натрия, хлорид натрия, ацетат натрия, хлорид магния, 4-хлоро-1-нафтол, бромистый этидий, ß-меркаптоэтанол, бычий сывороточный альбумин фракция V (БСА), глицин (Sigma, США); акриламид, N’,N’-метиленбисакриламид, додецилсульфат натрия (ДСН), мочевину sequence grade, нитроцеллюлозную мембрану Hybond С extra (Amersham, США); nonidet Р-40 (NP40); агар, триптон, дрожжевой экстракт (Difco, Великобритания); металлохелатный сорбент Talon (BD, США); глицин, изопропил-ß-D-тиогалактопиранозид (IPTG) (Fermentas, Литва); раствор ТМВ (тетраметилбензидина) (США), остальные реактивы отечественного производства марки “осч” (особо чистые); полный адъювант Фрейнда (Sigma, США). Pertussis toxin (Calbiochem, США); Культуральные среды и их компоненты (Gibco, США); 3-Maleimidobenzoic acid N-hydroxysuccinimide ester (MBS, Sigma, США); ФИТЦ (Sigma, США); Панкреатический ингибитор РНКазы A (Fermentas, Литва); Туберкулин (BD Difco, США);
Ферменты: термостабильную ДНК-зависимую ДНК-полимеразу, щелочную фосфатазу, Rapid DNA Ligation kit (Fermentas, Литва), эндонуклеазы рестрикции и соответствующие стандартные буферные растворы (Fermentas, Литва); дезоксирибонуклеазу I (Biozyme Laboratories ltd, США); трипсин, лизоцим (Merck, Германия); маркеры размера фрагментов ДНК и молекулярной массы: GeneRuler 50 bp DNA Ladder; GeneRuler 1 k DNA Ladder, Protein Molecular Weight Marker 14.4-116.0 кДа, Prestained Protein Molecular Weight Marker 19.0-118.0 кДа (Fermentas, Литва); низкомолекулярный маркер 2.5-16.9 кДа (Amresham, США); коньюгат Streptavidin-Pacific Blue (BD, США);
Антитела: антитела к с-тус эпитопу, продуцируемые гибридомой C-MYC; антитела козы к Fc-фрагменту IgG мыши и человека, антитела козы к Fc-фрагменту