Исследование структуры белков P-выступа большой субчастицы архейной рибосомы

• Автор: Митрошин, Иван Владимирович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 113 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ Ы2/Р-ВЫСТУПА РИБОСОМЫ
1. Компоненты 1Л2/Р-выступа рибосомы
1.1. Бактериальные белки L10, LI 1 и LI
1.2. Белки эукариотического и архейного Р-выступа
2. Взаимозаменяемость бокового выступа бактерий, архей и эукариот
3. Кристаллографические исследования Ы2/Р-выступа в составе рибосом
Заключение
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. Материалы
1.1. Химические материалы
1.1.1. Реактивы и ферменты
1.1.2. Буферы
1.1.3. Питательные среды
1.2. Биологические материалы
1.2.1. Бактериальные штаммы
1.2.2. Плазмиды
1.3. Принадлежности
1.4. Приборы
2. Методы
2.1. Методы генной инженерии
2.1.1. Полимеразная цепная реакция
2.1.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.1.3. Обработка фрагментов ДНК сайт-специфичсскими эндонуклеазами рестрикции.
2.1.4. Очистка фрагментов ДНК
2.1.5. Лигирование фрагментов ДНК
2.1.6. Получение компетентных клеток E. coli
2.1.7. Трансформация компетентных клеток E. coli лигазной смесью («Бело-голубой тест»)
2.1.8. Анализ клонов клеток методом ПЦР
2.1.9. Трансформация компетентных клеток E. coli плазмидной ДНК
2.1.10. Выделение плазмидной ДНК

2.1.11. Рестрикция и очистка плазмидной ДНК для транскрипции
2.1.12. Фенольная депротеинизация нуклеиновых кислот
2.1.13. Экспрессия рекомбинантных генов белков КЦаРОМТЕ, ГЩаЫ I
2.1.14. Экспрессия гена белка М]аЫ 1 для получения селенометионинового
производного белка
2.2. Биохимические методы при работе с белками
2.2.1. Выделение белков М)аР0ЫТЕ, ГЩаЫ 1 и Бе-Ме1 М]аЫ
2.2.2. Хроматографическая очистка белка ГЩаРОМТГ
2.2.3. Хроматографическая очистка белка ГуЦаЬ 11 и его селенометионинового производного
2.2.4. Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях
2.2.5. Электрофорез в ПААГ в неденатурирующих условиях pH 4.
2.3. Биохимические методы при работе с РНК
2.3.1. Получение специфических фрагментов рРНК
2.3.2. Электрофорез РНК в ПААГ в денатурирующих условиях с мочевиной
2.3.3. Электрофорез белка, РНК, РНК-белковых комплексов в ПААГ в неденатурирующих условиях
2.3.4. Получение РНК-белковых комплексов
2.3.4.1. Образование комплексов М)аР0МТР с фрагментами 23Б рРНК разной длины
2.3.4.2. Образование комплекса 1УЦаР0ЫТГ-М)аЫ 1-23БрРНК(74)
2.3.4.3. Образование комплекса М)аР0МТГ-М|аЫ 1-238рРНК(74)-тиострептон
2.4. Кристаллизация белка и РНК-белковых комплексов
2.5. Кристаллографичекие методы
2.5.1. Съемка и обработка дифракционных данных
2.5.2. Анализ содержания ячейки
2.5.3. Определение и уточнение структур
2.5.3.1. Переуточнение структуры РО*(РП4ТО)б из Р. Ъопкозкп
2.5.3.2. Определение и уточнение структуры УЦаЫ
2.5.3.3. Определение и уточнение структуры М|аР0МТГ-238рРНК(74)
2.5.3.4. Определение и уточнение структуры М]аР0МТГ-1И)аЫ 1-238рРНК(74)
2.5.3.5. Определение и уточнение структуры М]аР0МТГ-М)аЫ 1-238рРНК(74)-тиострептон
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Кристаллизация и определение структур компонентов Р-выступа архейной рибосомы.

1.1. Изолированный рибосомный белок Ы 1 из архей М. ЗаппаясМі
1.2. Фрагмент белка РО, РОЫ'П', в комплексе со специфичным фрагментом 23в рРНК.,
1.3. Тройной комплекс МіаРОМТР-МіаІЛ 1-238рРНК(74)
1.4. Комплекс М]аРОШТ-М)аЫ 1-238рРНК(74) с тиострептоном
1.5. Переуточнение структуры комплекса Р0-(Р 1ЫТО)б из архей Р. ЬогісояМі
2. Анализ структур компонентов архейного рибосомного Р-выступа
2.1. Структура изолированного рибосомного белка М)аЫ
2.2. Анализ структур комплексов ІУуаРОІчІТР со специфичным фрагментом 238 рРНК в отсутствии и присутствии МіаІЛ I
2.3. Взаимодействие белков архейного рибосомного Р-выступа с 238 рРНК
2.4. Взаимодействие архейного рибосомного Р-выступа с антибиотиком тиострептоном
2.5. Подвижность компонентов основания Р-выступа архейной рибосомы
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ

методами химического пробинга и фут-принтиига. В комплексе с белками Р1/Р2 повышается сродство белка РО к рРНК (Uchiumi and Kominami, 1997). Наиболее вероятно, что Р1/Р2 выполняют дополнительную функцию модулятора при связывании белка РО с рибосомой.
Эукариотический рибосомный белок L12e является функциональным аналогом архейного и бактериального белка L11. В клетках дрожжей S. cerevisiae белок L12e кодируется двумя генами, rpL12A и rpL12B, которые продуцируют идентичные полипептиды. Удаление обоих генов белка L12e сильно влияет на рост клеток, но клетки остаются жизнеспособными (Briones et al., 1998). С помощью химического сшивания соседних молекул показано, что белок L12e взаимодействует с эукариотическими факторами элонгации eEFla и eEF2 (Uchiumi et al., 1986).
Белок L12e связывается с 26/28S рРНК в участке, эквивалентном участку связывания бактериалыюго/архейного белков L11 на 23S рРЫК. Белок L12e из крысы защищает около 60 н. о. 28S рРНК от расщепления рибонуклеазой Тц связываясь с участком 1766-1825 н. о., а дрожжевой L12e защищает от расщепления участок 1222-1283 н. о. 26S рРНК (El-Baradi et al., 1987). Если участок связывания белка LI 1 в рибосоме из E. coli заменить на участок связывания белка L12e из дрожжей, то с такой гибридной рибосомой могут связаться как эукариотический L12e, так и бактериальный белок L11. Такая гибридная рибосома поддерживает гидролиз ГТФ с помощью бактериального фактора элонгации EF2 (Thompson et al., 1993). Наиболее вероятно, что несмотря на консервативные РНК-белковые взаимодействия рРНК и белков L11 и L12e, эукариотические белок-белковые взаимодействия между белком L12e и факторами трансляции отличаются от аналогичных взаимодействий в бактериях (Garcla-Marcos et al., 2007).
Стоит заметить, что до сих пор не определена пространственная структура изолированного эукариотического белка L12e. Известна только структура L12e в составе дрожжевой рибосомы в виде полиаланиновой цепи (Рис. 19Б) (Ben-Shem et al., 2011).
Архейный белок LI 1 гомологичен бактериальному белку L11 (степень гомологии белков L1I из E. coli и Sulfolobiis solfataricus равна 50%) (Casiano and Traut, 1991). В настоящее время пространственная структура архейного белка LI 1 частично визуализирована только в составе 50S субчастицы рибосомы из H. marismortui (Рис. 19В) (Gabdulkhakov et al., 2013). Белок L11 состоит из двух доменов, соединенных короткой перетяжкой. Из-за плохого качества электронной плотности в районе N-концевого домена детали структуры этого домена плохо различимы. Компактный LI 1CTD образован пятью а-спиралями (Gabdulkhakov et al., 2013).