Механизмы координации транскрипции с трансляцией и репарацией ДНК у Escherichia coli

• Автор: Прошкин, Сергей Александрович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 104 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение
1. Регуляция элонгации транскрипции у бактерий (обзор литературы)
1.1. Структура и функции элонгационного комплекса РНК-полимеразы
1.1.1. Функциональные участки РНК-полимеразы
1.1.2. Каталитические активности
1.1.3. Цикл присоединения нуклеотидов
1.1.4. Транслокация
1.2. Регуляция элонгации транскрипции
1.2.1. Неравномерность элонгации: паузы, терминация и антитерминация транскрипции
1.2.2. Регуляторные белки
2. Материалы и методы
2.1. Материалы
2.2. Методы
3. Результаты
3.1. Координация транскрипции и трансляции
3.1.1. Скорость транскрипции и трансляции in vivo в различных условиях роста клеток
3.1.2. Структурные изменения элонгационного комплекса РНК-полимеразы под влиянием рибосомы
3.1.3. Влияние рибосомы на прохождение РНК-полимеразой участков ДНК, связанных с белками
3.2. Координация транскрипции и репарации ДНК
3.2.1. Воздействие фактора Mfd на элонгационный комплекс РНК-полимеразы in vivo
3.2.2. Роль фактора UvrD в координации транскрипции и репарации ДНК
3.2.3. Участие транскрипционного фактора NusA в координации транскрипции с репарацией ДНК
. 4. Обсуждение результатов
4.1. Модель координации транскрипции с трансляцией
4.2. Модель координации транскрипции с репарацией ДНК
5. Выводы
Список сокращений
Список литературы

ВВЕДЕНИЕ
Транскрипция, осуществляемая РНК-полимеразой, - ключевой этап экспрессии генов и клеточной регуляции. Элонгационный комплекс, включающий РНК-полимеразу, матрицу ДНК и синтезируемую РНК, - центральный интермедиат в транскрипционном цикле, который служит конечной мишенью для различных регуляторных белковых факторов и сигналов, закодированных в ДНК и/или РНК. В течение последних нескольких лет было получено много структурных и биохимических данных, которые проливают свет на молекулярные детали функционирования бактериальной РНК-полимеразы [1-4]. Взаимодействие элонгационного комплекса РНК-полимеразы с компонентами других клеточных процессов (трансляции, репликации или репарации ДНК) позволяет координировать транскрипцию с последующими этапами генной экспрессии, лежит в основе механизма поддержания стабильности генома и сопряжения транскрипции с репарацией ДНК [5]. Изучение механизмов, определяющих взаимосвязь этих важнейших молекулярных машин,- актуальная фундаментальная проблема, на решение которой было направлено диссертационное исследование.
Транскрипция и трансляция у бактерий сопряжены в пространстве и во времени. Инициация трансляции большинства бактериальных мРНК начинается вскоре после экспонирования рибосом-связывающего участка (RBS) РНК на выходе из РНК-связывающего канала РНК-полимеразы. Хотя о связи транскрипции и трансляции в бактериях известно уже несколько десятилетий, механизм, лежащий в основе координации этих процессов, был описан лишь для специфических случаев полярного эффекта и аттенюации транскрипции [б]. Остановка трансляции мРНК одного из генов (например, из-за нонсенс-мутации) нарушает экспрессию расположенных за ним генов, входящих в состав той же транскрипционной единицы (полярный эффект). Образующийся в этом случае разрыв между транслирующими рибосомами и РНК-полимеразой дает возможность фактору Rho связать РНК и терминировать транскрипцию [7]. Рибосомы также ответственны за преждевременную терминацию транскрипции в аттенюаторах ряда метаболических оперонов, влияя на образование Rho-независимых терминационных шпилек в РНК [8]. В каждом из этих феноменов эффект рибосомы на РНК-полимеразу опосредован или фактором Rho, или специфической вторичной структурой РНК. В то же время оставался неясен механизм синхронизации скоростей транскрипции и трансляции, которые зависят от скорости роста бактерий в различных условиях [9]. В данной работе мы обнаружили, что транслирующая рибосома напрямую ассистирует РНК-полимеразе в ходе элонгации транскрипции.

Клеточные РНК-полимеразы очень чувствительны к отклонениям в структуре матричной цепи ДНК, и в случае повреждения ДНК транскрипция на этом месте временно или постоянно блокируется [10-11]. Таким образом, РНК-полимераза может служить сенсором, осуществляющим контроль качества ДНК во время транскрипции. Скорость репарации нуклеотидов активно транскрибируемых генов обычно выше, чем нетранскрибируемых участков генома, причем матричная цепь ДНК исправляется быстрее нематричной [12]. Это явление получило название репарации, сопряженной с транскрипцией (transcription-coupled repair, TCR), и описано как путь глобальной эксцизионной репарации нуклеотидов у бактерий и у эукариот [13-14]. В ходе транскрипции РНК-полимераза останавливается на поврежденных участках ДНК. Для исправления повреждения ДНК к соответствующему участку необходим доступ белков системы репарации, поэтому остановленная РНК-полимераза должна быть удалена с матрицы (терминация транскрипции) или отодвинута в сторону от повреждения. Известная на сегодняшний день модель сопряженной с транскрипцией репарации ДНК у бактерий основана на использовании фактора Mfd, действующего на остановленные элонгационные комплексы РНК-полимераз и терминирующего транскрипцию. Мы обнаружили, что хеликаза UvrD может быть ключевым компонентом альтернативного пути сопряжения транскрипции с репарацией ДНК.
Целью настоящей работы являлось выяснение механизмов взаимосвязи транскрипции с трансляцией и репарацией ДНК у Escherichia coli. В ходе работы решались следующие задачи: определение скорости транскрипции и трансляции в зависимости от генотипа и условий роста клеток; установление влияния транслирующей рибосомы in vivo на структурные изменения элонгационного комплекса РНК-полимеразы и эффективность преодоления им белковых препятствий на ДНК-матрице; определение эффектов белков Mfd и UvrD на элонгационный комплекс РНК-полимеразы in vivo; изучение с использованием генетических подходов влияния различных элонгационных факторов на сопряжение транскрипции с репарацией ДНК.
В результате данного исследования открыты новые механизмы координации транскрипции с трансляцией и репарацией ДНК у бактерий. В частности, впервые показано, что лидирующая рибосома препятствует спонтанному возвратному смещению РНК-полимеразы в ходе транскрипции in vivo и облегчает прохождение РНК-полимеразой участков ДНК, связанных с белками. Функциональное взаимодействие между двумя молекулярными машинами у бактерий позволяет подстраивать транскрипцию к трансляционным потребностям на разных генах в разных условиях роста клетки [15].

нуклеотидных позициях. Это означает, что в то время как одна РНК-полимераза образует непродуктивный комплекс, следующая за ней молекула может находиться в активном состоянии, сдвигая равновесие первой молекулы также к активному состоянию.
Взаимодействие между комплексами элонгации облегчает также преодоление препятствий в виде связанных с матрицей белков in vitro и in vivo [163]. Анализ конформаций элонгационных комплексов показал, что при встрече с препятствием РНК-полимераза находится в непродуктивном состоянии, вызванным возвратным смещением комплекса. Для прохождения препятствия необходимо выполнение двух шагов: 1) реактивации
элонгационного комплекса и 2) смещения и/или диссоциации белка-препятствия. Кооперация между РНК-полимеразами позволяет ускорить первый шаг без использования эндонуклеазного расщепления РНК путем смещения непродуктивного комплекса вперед по ходу транскрипции. Второй шаг, зависящий от природы контактов репрессора и ДНК, также может подвергаться влиянию первого шага из-за локальных изменений в структуре ДНК и/или стерических затруднений между белками. Тот же механизм, как выяснилось в опытах in vitro, может способствовать преодолению нуклеосом [164].