Пуринергическая и адренергическая сигнальные системы мезенхимных стромальных клеток

• Автор: Котова, Полина Дмитриевна
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 91 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Мезенхимные стромалыше клетки

1.1. История изучения МСК

1.2. Идентификация и культивирование МСК

1.3. Мультипотентность МСК

1.4. Участие МСК в регенерации тканей

1.5. Участие МСК в формировании пиши тканеспецифических стволовых клеток

П. Внутриклеточная кальциевая сигнализация

II. 1. Общие представления о внутриклеточной кальциевой сигнализации
11.2. Кальциевые каналы плазматической мембраны
11.3. Кальциевые каналы мембран кальциевых депо
11.4. Кальциевые насосы внешней и внутренних мембран клетки
11.5. Кальциевая сигнализация в мезенхимных стромальных клетках
III. Адренергическая сигнальная система
III. 1. Краткая история исследования адренергических рецепторов
111.2. Классификация адренергических рецепторов и активируемые ими сигнальные пути
111.3. Адренергические рецепторы в МСК
111.4. Направленный агонизм
IV Пуринэргическая сигнальная система
IV.1. Аденозиновые (Р1) рецепторы
IV.2. Р2-рецепторы
IV.3. Пуринергическая сигнализация в МСК
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Выделение МСК из жировой ткани и их культивирование
2. Подготовка клеток к эксперименту
3. Методика и экспериментальная установка для микрофотометрии
4. Методика и экспериментальная установка для фотолиза химических групп (uncaging)
5. Стимуляция клеток агонистами

6. Статистическая обработка данных
7. Методика иммунофлуоресцентного окрашивания
8. ОТ-ПЦР
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
I. Функциональная гетерогенность МСК
II. Механизм генерации МСК Са2+ ответов на норадрепалчп
II. 1. Фосфоинозитидный трансдукциооный каскад в ответах МСК на норадрсналин
11.2. Зависимость ответов МСК на норадреналин от его концентрации
11.3. Усиление Са2+-ответа МСК на норадреналин с помощью Са2+-индуцированного выброса Са2+ из внутриклеточных депо
11.4. Роль 1Рз- и рианодиновых рецепторов в генерации ответов МСК на норадреналин
11.5. Типы адренорецепторов, обеспечивающие чувствительность МСК к норадреналину
11.6. Предполагаемый механизм генерации ответов МСК на норадреналин
III. Механизм генерации МСК Са2+ ответов наАТР
III. 1. Типы пуринорецепторов, обеспечивающие чувствительность МСК к АТР
111.2. Фосфоинозитидный трансдукционый каскад в ответах МСК на АТР
111.3. Зависимость амплитуды ответов МСК на АТР от его концентрации
111.4. Усиление С a2 f-ответа МСК на АТР с помощью Са2+-индуцированного выброса Са2+ из внутриклеточных депо
111.5. Роль 1Р3- и рианодиновых рецепторов в генерации ответов МСК на скачкообразное повышение концентрации внутриклеточного Са2+
111.6. Предполагаемый механизм генерации ответов МСК на АТР
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
Мезенхимные стромальные клетки (МСК) представляют собой недифференцированные мультипотентные клетки, популяция которых поддерживается за счет пролиферации, и которые способны дифференцироваться в клетки как минимум костной, хрящевой и жировой тканей (Caplan, 2007; Dominici et al., 2009; Kalinina et al., 2011). МСК могут быть выделены из многих тканей взрослого организма, однако основными их источниками служат костный мозг и жировая ткань.
МСК обладают высоким терапевтическим потенциалом, и исследование различных аспектов их жизнедеятельности представляет несомненный академический и практический интерес. Большинство работ по исследованию МСК посвящены оценке их трансплантационного потенциала, исследованию механизмов, инициирующих и направляющих их дифференцировку, или анализу возможности управлять этими процессами in vitro. Гораздо меньшее внимание уделяется фундаментальным исследованиям сигнальных процессов в этих клетках. В силу этого существующие представления о рецепторных и сигнальных системах МСК весьма ограничены. Между тем естественно полагать, что межклеточные и внутриклеточные коммуникации, паракринные и аутокринные регуляции, вовлекающие различные сигнальные молекулы и рецепторные системы, должны играть ключевую роль в физиологических процессах, детерминирующих жизнедеятельность МСК. Исследования Са2+ сигнализации в МСК представлены единичными работами и касаются изучения спонтанных кальциевых осцилляций и участия внешнего кальция в развитии МСК (Ye, 2010). Тогда как более актуальным представляется изучение индуцированной Са2+ сигнализации, в том числе, агонистами различных рецепторов, т.к. среди них могут оказаться агенты, контролирующие пролиферацию МСК и запускающие их дифференцировку (Doze, Perez, 2012), что представляет несомненный практический интерес. В данной работе исследовалась Са2+ сигнализация, инициируемая пуринергическими и адренергическими агонистами в цитоплазме МСК, выделенных из жировой ткани человека.
Пуринергичсская сигнальная система была выбрана нами в связи с тем, что повреждение тканей ассоциируется с выбросом большого количества АТР во внеклеточную среду, который может стимулировать МСК, мигрирующие в зону повреждения. Поэтому можно ожидать, что пуринергическая сигнальная система является естественной частью системы регуляции клеточных функций МСК. Адренергическая система привлекла наше

собой покровное стекло (Menzel-Glaser, Германия) с пластиковыми бортиками, и затем загружали флуоресцентным Са2+-зондом Fluo-4. Для этого клетки инкубировали при комнатной температуре (23-25 °С) в присутствии проникающего аналога Fluo-4AM (4 мкМ) и детергента Pluronic (0.02%) (оба Molecular Probes, США) 20 мин, в течение которых гидролиз внутриклеточными эстеразами ацетоксиметиловой группы Fluo-4AM продуцировал остаточное количество Fluo-4. Затем клетки при 4 °С в течение 40 мин отмывали внеклеточным раствором.
Состав внеклеточного раствора (мМ): 110 NaCl, 5.5 KCl, 2 СаСЬ, 0.8 MgSC>4, 10 HEPES, 10 глюкоза (все Sigma-Aldrich).
3. Методика и экспериментальная установка для микрофотометрии
Эксперименты проводили с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 135 (Zeiss, Германия), оборудованного объективом Plan NeoFluar 20х/0.75 и цифровой ECCD камерой LucaR (Andor Technology, США). Помимо осветителя проходящего света микроскоп был оборудован оптоволоконным осветителем для освещения через объектив. Один из входов бифуркационного оптического волокна соединяли с осветителем на сверхъярких диодах (340-535 нм) (Хохлов, 2007) для возбуждения флуоресценции. Флуоресценцию клеток, нагруженных Fluo-4, возбуждали на длине волны 480 ± 5 нм, а эмиссию регистрировали в области 535 ± 20 нм. Каждые 0.5 секунды регистрировали последовательные флуоресцентные изображения. Изменение концентрации цитозольного кальция в индивидуальных клетках оценивали по относительному изменению интенсивности флуоресценции целой клетки (AF/Fo). Количественный фотометрический анализ изображений осуществляли с использованием программы Imaging Workbench 6 (INDEC, США).
4. Методика и экспериментальная установка для фотолиза химических групп (uncaging)
В работе использовали Ca2+-uncaging, который позволяет скачкообразно повышать концентрации внутриклеточного Са2+, и заключается в следующем: клетки инкубируются в присутствии фоточувствительного Са2+-хелатора NP-EGTA AM (Molecular Probes, США), который связывает свободный Са2+ внутри клетки, облучение же хелатора в ультрафиолетовом диапазоне приводит к разрушению координационной сферы связывания Са:+ и к его высвобождению, вследствие чего концентрация свободного Са2+ внутри клетки скачкообразно повышается. Одновременная загрузка клеток Fluo-4 и фоточувствительным Са:+ хелатором NP-EGTA позволяет оценивать изменение концентрации цитозольного Са2+ за счет Fluo-4 и скачкообразно повышать ее в нужный момент за счет NP-EGTA.