Исследование и оптимизация бесклеточных систем экспрессии для производства рекомбинантных белков

• Автор: Копеина, Гелина Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 108 с. : ил.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Бесклеточные системы синтеза белка

1.1.1. История создания бесклеточных систем синтеза белка

1.1.2. Развитие технологии бесклеточных систем синтеза белка

1.1.3. Эффективность синтеза белка в прокариотических и эукариотических бесклеточных системах

1.2. Формирование нативной структуры белка

1.3.Способы решения проблемы агрегации белка в БСС

1.3.1. Использование шаперонов для решения проблемы агрегации синтезированного белка

1.3.2. Подбор условий для правильного замыкания дисульфидных связей

1.3.3. Бесклеточная продукция рекомбинантных белков в виде гибридных полипептидов
1.3.4. Бесклеточный синтез белков в присутствии специфичных лигандов
1.3.5. Бесклеточный синтез белков в присутствии мицелл детергентов
1.3.6. Использование липидсодержащих частиц для бесклеточного синтеза мембранных белков
1.4. Ренатурация белков
1.5. Структурные и функциональные особенности объектов исследования
1.5.1. Никотиновый ацетилхолиновый рецептор
1.5.2. Бактериородопсин
1.5.3. Потенциалозависимый Kf канала KvAP из Aeropymmpernix
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.1.1. Реактивы и ферменты
2.1.2. Штаммы
2.1.3. Плазмидные векторы
2.1.4. Питательные среды для роста бактериальных культур
2.1.5. Синтетические олигонуклеотиды
2.2. Методы
2.2.1. Общие молекулярно-генетические методы
2.2.2. Получение генетических конструкций
2.2.3. Синтез белка в бссклеточной системе на основе фракции S30 Е. coli
2.2.3.1. Выделение экстракта S30 из Escherichia coli
2.2.3.2. Синтез белка в сопряженной бссклеточной системе на основе экстракта S30 из Е. coli
2.2.4. Гсль-электрофорез белков в ПААГ в присутствии ДСН
2.2.5. Иммуноблотинг
2.2.6. Гель-фильтрация
2.2.7. Анализ белковых препаратов методом КД-спектроскопии
2.2.8. Ренатурация мутантного варианта внеклеточного домена нАХР (а7ВД/1УГЕ8) из осадка ТС
2.2.9. Исследование биологической активности a7B,D/DTES
2.2.10. Выделение белка, ассоциированного с липид-белковыми нанодисками
2.2.11. Выделение ВСД-KvAP из трансляционной смеси
2.2.12. Ренатурация ВСД-KvAP из осадка ТС
2.2.13. Получение ЯМР-спектров ВСД-KvAP
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Продукция внеклеточного домена а7нАХР в бесклеточной системе на основе бактериального экстракта S30 из£. coli
3.1.1. Мутагенез внеклеточного домена нАХР а7 типа
3.1.2. Оптимизация бесклеточной системы для продукции сПВД/ГУГЕБ
3.1.3. Синтез a7Bfl/DTES в растворимой форме
3.1.4. Ренатурация а7ВД/Т)ТЕБ из осадка трансляционной смеси
3.1.5. Исследование биологической активности сПВДЛЭТЕБ
3.2. Получение бактериородопсина из Exiguobacterium sibiricum в бесклеточной системе на основе
бактериального экстракта S30 из К coli
3.2.1. Синтез БР-ES в растворимой форме в присутствии детергентов

3.2.1. Синтез БР-ES в присутствии липид-белковых нанодисков
3.3. Получение вольт-сенсорного домена К4канала KvAP из Aeropyrum pernix в бесклеточной системе на основе бактериального экстракта S30 из E. coli
3.3.1. Получение селективно меченого аналога ВСД-KvAP
3.3.2. Синтез ВСД-KvAP в растворимой форме в присутствии детергентов
3.3.2. Синтез ВСД-KvAP в присутствии липид-белковых нанодисков
3.3.3. Ренатурация ВСД-KvAP из осадка трансляционной смеси
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АТФ - аденозинтрифосфат
а.о. - аминокислотный остаток
АХСБ - ацетилхолинсвязывающий белок
БР-Е8 - бактериородопсин из Exigu.obacte.rium яШпсит
БСС - бесклеточная система синтеза
ВСД-КуАР - вольт-сенсорный домен потенциалозависимого К+-канала
КуАР из А ег ору пт регтх
ГГХ - гуанидин гидрохлорид
ДДМ - п-додецил-|3-0-мальтопиранозид
ДМФГ - димиристоилфосфатидилглицерол
ДМФХ - димиристоилфосфатидилхолин
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ДОФГ - диолеилфосфатидилглицерол
ДСН - додецилсульфат натрия
ДТТ - 1,4-дитиотрейтол
ДФХ - додецилфосфохолин
ИДС - изомераза дисульфидных связей
КБМХ - карбамоилхолин
КД - круговой дихроизм
ККМ - критическая концентрация мицеллообразования
ЛБН - липид-белковые нанодиски
ЛДАО - лаурилдодециламиноксид
ЛС - лаурилсаркозин натрия
МБ - мембранный белок
м.д. - миллионная доля
мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота НАДФНг - никотинамидаденин динуклеотидфосфат нАХР - никотиновый ацетилхолиновый рецептор

денатурированного белка обычно наносят на колонку небольшими порциями [96].
Для проведения процедуры ренатурации белка также применяют аффинную и ионообменную хроматографии. При этом белок в денатурированном состоянии связывают с подходящим носителем, после чего денатурирующий раствор заменяют буфером для ренатурации. Этот подход позволяет избежать взаимодействия между молекулами полипептидов в процессе ренатурации, что снижает вероятность агрегации и повышает выход ренатурированного белка. Связывание денатурированного препарата белка со смолой требует формирования стабильного комплекса полипептид-носитель в присутствии высоких концентраций хаотропных агентов. Для решения этой проблемы было разработано несколько способов:
1) подбор условий, в которых молекулы белка прочно связываются с ионообменной смолой [97];
2) введение в аминокислотную последовательность белка специальных неприродных кластеров, способных связываться с определенными типами носителей (самый распространенный пример, гексагистидиновая последовательность) [98, 99, 100];
3) использование гибридных конструкций, содержащих
последовательность белка-партнера, способного связаться с аффинным носителем в присутствии хаотропных агентов [101].
Необходимо отметить, что описанные подходы позволяют совмещать
процедуру ренатурации и очистку белка, что делает их более
привлекательным по сравнению с вышеописанными методами разбавления или диализа.
Для повышения выхода ренатурированного белка в буфер добавляют различные вещества, способствующие формированию нативной
пространственной структуры белка. Например, используют ацетамид, мочевину в низкой концентрации, диметилсульфоксид, полиэтиленгликоль (ПЕГ), Ь-аргинин, мицеллы детергентов [86]. Также в работе [102] для