Роль протеинкиназы С и кальция в регуляции водной проницаемости клеток эпителия собирательных трубок почки крысы вазопрессином в постнатальном онтогенезе

• Автор: Каткова, Любовь Евгеньевна
• Шифр специальности: 03.00.13
• Научная степень: Кандидатская
• Место защиты: Б.м.
• Количество страниц: 122 с. : ил.

Список сокращений

Акутальность проблемы

Научная новизна

Научно-практическая значимость.;

Апробация материалов

Глава I. Обзор литературы

1.1. Морфофункциональная характеристика нефрона почки млекопитающих

1.2. Транспорт воды через эпителий собирательных трубок почки

1.3.Регуляция проницаемости апикальной мембраны клеток собирательных трубок вазопрессином
1.4. Кальций-зависимые пути регуляции водной проницаемости плазматической мембраны эпителия собирательных трубок вазопрессином

1.5. Модуляторы регуляции водной проницаемости эпителия

сбирательных трубок вазопрессином
Гб.Регуляция проницаемости базолатеральной мембраны
1.7. Становление механизма трансдукции сигнала АДГ в
постнатальном онтогенезе
1.8.Заключение
Глава II. Материалы и методы
2.1.Экспериментальные животные
2.2. Реактивы
2.3.Измерение водной проницаемости эпителия собирательных трубок
2.3.1 Растворы
2.3.2 Обработка стекол полилизином
2.3.3 Получение фрагментов собирательных трубок
2.3.4 Измерение водной проницаемости общей поверхности клеток собирательных трубок
2.3.5 Измерение водной проницаемости базолатеральной мембраны клеток собирательных трубок
2.3.6 Исследование влияния сЮАУР на водную проницаемость клеток эпителия собирательных трубок у крыс разного возраста

2.3.7. Оценка влияния проникающего аналога цАМФ - дбцАМФ на водную проницаемость клеток эпителия собирательных трубок
2.3.8. Исследование влияния внутриклеточного хелатора кальция ВАРТА на эффект сГОАУР и дб-цАМФ на водную проницаемость клеток эпителия собирательных трубок
2.3.9. Исследование влияния ингибитора протеинкиназы С на эффект (ГОАУР и дб-цАМФ на водную проницаемость клеток
эпителия собирательных трубок
2.4. Вестерн-блот анализ
2.4.1. Получение срезов почки и их инкубация с различными агентами
2.4.2. Полученение мембранной и цитозольной фракции наружного мозгового вещества почки
2.4.3. Измерение концентрации белка
2.4.5. Электрофоретическое разделение белков, перенос белко на
РУБР мембрану
2.4.6 Проведение Вестерн-блот анализа
2.5. Статистика
Глава III. Результаты исследований
3.1. Регуляция водной проницаемости клеток открытого конца собирательных трубок почки крысы и экспрессии А(ЗР2, АС>РЗ десмопрессином в постнатальном онтогенезе
3.2. Оценка экспрессии различных изоформ РКС в наружном мозговом веществе почки крыс разного возраста
3.3. Влияние внутриклеточного хелатора Са на десмопрессин-зависимое повышение водной проницаемости собирательных трубок почки крысы и содержание РКСа и водных каналов 2 и 3 типа
3.4. Подавление ингибитором РКС Яо-31-8220 эффекта десмопрессина на водную проницаемость базолатеральной мембраны клеток собирательных трубок почки крысы
3.5. Влияние ингибитора РКС Яо-31-8220 и внутриклеточного хелатора кальция ВАРТА на эффект цАМФ-дбцАМФ на водную проницаемость клеток эпителия собирательной трубки почки крысы
Глава IV. Обсуждение
Выводы
Список цитированной литературы

Список сокращений.
АДГ - антидиуретический гормон, вазопрессин
дбцАМФ -Ы6,02-дибутирил аденозин -3’- 5’ монофосфат
ОТ-ПЦР - обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция
СТ- собирательные трубки почки
цАМФ - 3’-5’ циклический аденозин монофосфат
цГМФ - 3’-5’ циклический гуанозин монофосфат
АЦ - аденилатциклаза
АОР - аквапорин, водный канал
ВАРТА-тетраоксиметиловый эфир 1,2 бис-(о-аминофенокси)-этан-N,N,N9,N9 тетрауксусной кислоты
сЮАУР- 1 -дезамино-8-Б-аргинин вазопрессин, десмопрессин РКА - цАМФ зависимая протеинкиназа РКС - кальций зависимая протеинкиназа

dDAVP и дб-цАМФ при предварительной прединкубации в среде МЕМ содержащей 15 мМ HEPES 10 мин. в тех же условиях, но без добавления Ro-31-8220.
2.4. Вестерп-блот анализ.
2.4.1. Получение срезов почки и их инкубация с различными агентами.
После декапитации животного почки извлекали и помещали на лед. Почки декортицировали, сохраняя наружную зону мозгового вещества, сосочек удаляли. С помощью бритвенного лезвия выделенное наружное мозговое вещество разделяли на срезы толщиной 2-3 мм. и помещали их в среду МЕМ с 15 мМ HEPES на лед. Инкубацию с различными агентами проводили в той же среде при 37° С в атмосфере 5% С02 и 95% воздуха.

Для оценки влияния dDAVP(10' М) срезы инкубировали в течение 30 мин. В качестве контроля использовали срезы проинкубированные в течение 30 мин. в тех же условиях, но без добавления dDAVP.
Для выявления эффекта связывания ионов кальция внутри клетки на содержание белка AQP2, AQP3 и РКСа с каждой почки получали 4 среза наружного мозгового вещества и помещали их в разные пробирки. После этого в третью и четвертую пробирки добаляли ВАРТА до концентрации 50 мкМ. Все срезы инкубировали в течение 30 мин. После чего во вторую и

четвертую пробирки добавляли dDAVP до концентрации 10'М и инкубировали еще 30 мин. После инкубации каждый срез разделяли на 2 части для получения цитозольной и мембранной фракций.
Для выявления действия ингибитора протеинкиназы С на содержание белка РКСа с каждой почки получали 4 среза наружного мозгового вещества и помещали их в разные пробирки. После этого в третью и четвертую пробирки добаляли Ro-31-8220 до концентрации 0,1 мкМ. Все срезы инкубировали в течение 10 мин. После чего во вторую и четвертую пробирки добавляли dDAVP до концентрации 10' М и инкубировали еще 30 мин. После