Особенности регуляции биосинтеза полигидроксибутирата у Methylobacterium extorquens

• Автор: Белова, Лариса Леонидовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Место защиты: Б. м.
• Количество страниц: 99 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Продуценты ПГБ
1.2 Метаболические пути синтеза ПГБ
1.3 Метаболизм ПГБ
1.4 Характеристика ферментов синтеза ПГБ
1.4,/3-кетотиолаза
1.4.2 НАДФН-зависимая ацетоацетт-КоА редуктаза
1.4.3 ПГА-синтаза
1.5 ВЗ АИМОСВЯЗЬ ЦТК И БИОСИНТЕЗА ПГБ
1.5.1 Свойства цитратсинтаз
1.5.2 Цитратсинтаза аэробных метилобактерий
1.6 Изоцитратдегидрогеназа и ее регуляция
1.7 Контроль синтеза полимера у продуцентов ПГБ
1.7.1 Регуляция синтеза ПГБ у Alcaligen.es еМгорйш
1.7.2 Регуляция синтеза ПГБ у Zoogloearamigera
1. 7.3 Синтез ПГБ представителями рода Азо!оЬас(ег
1.7.4 Регуляция синтеза ПГБ у Ме1Ьу1оЬас1егшт гЬодезшпит
1.8 Организация генов синтеза ПГБ
1.9 Влияние внутрицитоплазматических включений ПГБ на клеточный объем микроорганизмов
1.10 Заключение
2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Объект исследования и культивирование
2.2 Приготов ление бесклеточных экстрактов
2.3 Гель-фильтрация экстрактов на сефадексе
2.4 Определение активностей ферментов
2.5 Очистка НАДФН-ацетоацетил-КоА редуктазы
2.6 Очистка цитратсинтазы
2.7 Очистка НАДФ+-изоцитратдегидрогеназы
2.8 Определение кинетических параметров НАДФН-ацетоацетил-КоА редуктазы, цитратсинтазы и НАДФ+-изоцитратдегидрогеназы
2.9 Определение оптимального значения pH
2.10 Определение молекулярной массы нативных ферментов
2.11 Измерение интенсивности дыхания
2.12 Определение включения 2С14-ацетата в ПГБ
2.13 Экстракция и определение внутриклеточного содержания метаболитов
2.14 Аналитические методы
2.15 Реактивы
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1 Метаболические изменения у М Ехтояоитя при синтезе ПГБ
3.2 Очистка и характеристика НАДФН-ацетоацетил-КоА редуктазы
3.2.1 Процедура получения препарата НАДФН-ацетоаііетш-КоА редуктазы
3.2.2 Свойства НАДФН- ацетоацетил-КоА редуктазы
3.3 Очистка и характеристика цитратсинтазы
3.3.1 Процедура получения гомогенного препарата цитратсинтазы
3.3.2 Свойства цитратсинтазы
3.4 Очистка и характеристика ГІАДФ+-изоцитратдегидрогеназьі
3.4.1 Получение препарата НАДФ' -изоцитратдегидрогеназы
3.4.2 Свойства НАДФ-изоцитратдегидрогеназы
3.5 Влияние специфических ингибиторов на включение 2ы С-ацетата в ПГБ
3.6 Внутриклеточные концентрации пиридиннуклеоттщов и АТФ
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1 Метаболический путь синтеза ПГБ у М. Ехтояотт
4.2 Роль изоцитратдегидрогеназы и формиатдегидрогеназы в обеспечении синтеза ПГБ НАДФН
4.3 Регуляция синтеза ПГБ у М. ЕХТОядиЕ№
4.3.1 Свойства НАДФН-ацетоацетш-КоА редуктазы
4.3.2 Свойства цитратсинтазы
4.3.3 Свойства НАДФ" -изоцитратдегидрогеназы
4.3.4 Динамика активностей ферментов и внутриклеточных концентраций пиридиннуклеотидов и АТФ во время синтеза ПГБ
4.4 Сравнительный анализ регуляторных моделей сериновых мегилотрофов
4.5 Роль ЦТК в биосинтезе ПГБ
5. ВЫВОДЫ
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ПГБ - полигидроксибутират
ИДГ - изоцитратдегидрогеназа
АКР - ацетоацетил-КоА редуктаза
ЦТК - цикл трикарбоновых кислот
ЦС - цитратсинтаза
КоА - кознзим А
А-КоА - ацетил-КоА
Аа-КоА - ацетоацетил-КоА
БСА - бычий сывороточный альбумин
ДТТ - дитиотреитол
ДТНБ - дитионитробензоат
ДХФИФ - дихлорофенолиндофенол
ФМС - феназинметосульфат
ОРС - открытая рамка считывания
кДа - килодальтон
Трис - трис(гидроксиметил)аминометан
ПЭГ-6000 - полиэтиленгликоль с молекулярной массой 6000
ЭДТА - этилендиаминтетраукеусная кислота
ицл - изоцитратлиаза
СССР - карбоиилцанид-т-хлорофенилгидразон
ХЕПЕС - Н-|2-1Идроксютил]ниперазин-Ы’[2-этан)сульфоновая кислота
ВЕАЕ - диэтиламиноэтил
ТГФ - тетрагидрофолат
МПТ - ме ганоптерин
МТГФ - метилентетрагидрофолат
МТГМПТ - метилететрагидрометаноптерин
ТХУ - трихлоруксусная кислота
БЦБ - додецилсульфат натрия
ПААГ - полиакриламидный гель
дА мин 1 - изменение оптического поглощение в минуту
ацетил-КоА направляется главным образом в ЦТК. Напротив, в лимите по азоту внутриклеточная концентрация НАДН определяет только 25% активности ЦС, уровень КоА быстро снижается, благодаря чему активность ß-кетотиолазы значительно возрастает. Изменения в активности ЦС приводят, по-видимому, к возрастанию концентрации ацетил-КоА, что также способствует увеличению активности ß-кетотиолазы.
При росте ка фруктозе М. rhodesianum накапливал ПГБ в экспоненциальной фазе роста, когда нет ограничения в питательных веществах (Ackermann and Babel, 1997).
Такое различие в накоплении ПГБ при росте на метаноле и фруктозе отражает отличие в физиологических функциях образующегося продукта. Синтез ПГБ в лимитированных условиях культивирования на метаноле играет роль стока электронов. Напротив, во время роста на фруктозе образуется недостаточно энергии, возможно, из-за низкой активности ЦТК. Рассматривая синтез ПГБ из фруктозы как вид ферментации, производящей восстановительную энергию, авторы выдвигают гипотезу «узкого места» в продукции энергии при росте на фруктозе, что вызывает ассоциированный с ростом синтез ПГБ. Основанием для данной гипотезы служит сравнение потоков утлерода с активностями ферментов ЦТК и синтеза ПГБ, а также влияние окисления формиата на синтез полимера. Дополнительная к фруктозе подача формиата, который выступает в виде самостоятельного и независимого от ЦТК генератора НАДН, репрессировал синтез ПГБ у М. rhodesianum, хотя рост при этом продолжался (Ackermann and Babel, 1997)
Исследование внутриклеточных концентраций КоА, ацетил-КоА, НАД(Ф)(Н), АТФ, АДФ, АМФ у М. rhodesianum (Motbes et а!., 1998) показало, что концентрация КоА (0,037мМ) при росте на фруктозе позволяет ß-кетотиолазе сохранить активность на уровне 20% от активности в экстракте, что, видимо, обеспечивает синтез ПГБ . Концентрации НАДФН и НАДН (0,37 и 0,31мМ, соответственно) при росте на фруктозе таковы, что насыщают НАДН-АКР и НАДФН-АКР и, по-видимому, не регулируют синтез ПГБ в данных условиях. Однако уровни указанных веществ, за исключением АМФ и АДФ, уменьшаются при переходе М. rhodesianum с метилотрофного роста на накопление ПГБ на фруктозе, в то время как активности ß-кетотиолазы, НАДН-АКР, НАДФН-АКР и ЦС существенно не изменяются. Это противоречит данным о свойствах ферментов и наводит на мысль о существовании дополнительных регуляторных механизмов, обусловливающих не индуцированный синтез полимера на фруктозе.
Другие дополнения в регуляторную модель М rhodesianum могут появиться в связи с исследованием метаболических путей синтеза ПГБ. Принято считать, что метилотрофные продуценты ПГБ синтезируют гомополимер «классическим», трехста-