Изучение молекулярных механизмов организации цитоскелета и регуляции клеточной подвижности протеинкиназой LOSK/SLK

• Автор: Фокин, Артём Игоревич
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 140 с. : ил.

1. Оглавление
1. Оглавление
2. Введение
2.1. Актуальность темы исследования
2.2. Цель работы
2.3. Задачи исследования
2.4. Новизна полученных результатов
2.5. Апробация результатов исследования
3. Обзор литературы
3.1. Серин-треониновая протеинкиназа ЬОБК/БЬК
3.2. Цитоскелет и его функции в животных клетках
3.2.1. Микротрубочки
3.2.1.1. Белки, ассоциированные с микротрубочками (МАР)
3.2.1.2. Моторные белки микротрубочек
3.2.1.3. Динеин-динактиновый комплекс
3.2.2. Центр организации микротрубочек
3.2.2.1. Структура центросомы
3.2.2.2. Роль центросомы в организации микротрубочек
3.2.2.3. Регуляция организации центросомных микротрубочек
протеинкиназами
3.2.3. Альтернативные способы организации микротрубочек
3.2.3.1. Организация микротрубочек в отсутствие центросомы в
клетке
3.2.3.2. Участие аппарата Гольджи в организации микротрубочек
3.2.4. Промежуточные филаменты
3.2.5. Актиновые филаменты
3.3. Малые ГТФазы
3.3.1. Малая ГТФаза ШюА
3.3.2. Клеточная подвижность и поляризация клеток
4. Материалы и методы
4.1. Материалы
4.1.1. Оборудование
4.1.2. Расходные материалы
4.1.3. Биологический материал
4.1.3.1. Иммортализованные эукариотические линии клеток
4.1.3.2. Бактериальные штаммы:
4.1.4. Основные реагенты
4.1.5. Ферменты и ДНК-вектора
4.1.6. Готовые наборы для молекулярно-биологических работ
4.1.7. Среды для культивирования и основные буферные растворы
4.1.8. Синтетические олигонуклеотиды
4.1.9. Генетические конструкции
4.1.10. Антитела
’ I 8 Т ИЗПШ! I ИЩИ 1Ш11 11ШВ ЯПНП НШ1Т1

4.2. Методы
4.2.1. Работа с эукариотическими клетками
4.2.1.1. Культивирование клеточных линий
4.2.1.2. Липосомная трансфекция клеток плазмидной ДНК
4.2.1.3. Химические воздействия на клетки
4.2.1.4. Фиксация клеток и иммуноцитохимическое окрашивание
4.2.1.5. Анализ миграции клеток в рану монослоя
4.2.1.6. Получение цитопластов
4.2.1.7. Иммунофлуоресцентная микроскопия и прижизненные
наблюдения клеток
4.2.1.8. Обработка результатов
4.2.2. Работа со штаммами E. coli
4.2.2.1. Получение компетентных клеток E. Coli
4.2.2.2. Трансформация бактерий
4.2.2.3. Синтез рекомбинантных белков в E. Coli
4.2.3. Методы молекулярного клонирования
4.2.3.1. Выделение тотальной РНК из клеток
4.2.3.2. Определение концентрации нуклеиновых кислот
4.2.3.3. Синтез кодирующей ДНК с мРНК
4.2.3.4. Полимеразная цепная реакция
4.2.3.5. Сайт-направленный мутагенез
4.2.3.6. Электрофорез ДНК в агарозном геле
4.2.3.7. Выделение ДНК из геля
4.2.3.8. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции
4.2.3.9. Лигирование фрагментов ДНК
4.2.3.10. Выделение плазмидной ДНК
4.2.4. Работа с белками
4.2.4.1. Выделение и очистка рекомбинантных белков
4.2.4.2. Киназная реакция in vitro
4.2.4.3. Иммунопреципитация
4.2.4.4. Приготовление клеточных гомогенатов для белкового
электрофеза
4.2.4.5. Белковый электрофорез в денатурирующих условиях
4.2.4.6. Окрашивание полиакриламидных гелей
4.2.4.7. Влажный перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану
4.2.4.8. Окрашивание антителами и проявление
5. Результаты
5.1. Генетические конструкции, полученные в работе
5.2. Фосфорилированиер150С1иЫ киназой LOSK
5.2.1. Каждый из треонинов 145-147 изоформы 1А белка pl50Glued может
быть фосфорилирован киназой LOSK in vitro
5.2.2. Мутации pl50Glued в сайте узнавания LOSK, обнаруженные у
больных амиотрофическим склерозом, усиливают его фосфорилирование
5.3. Участие протенкиназы LOSK в регуляции внутриклеточного
транспорта и функций динактина
5.3.1. Полноразмерные GFP-слитые молекулы нефосфорилируемого и
имитирующего фосфорилирование pl50G1“ed включаются в динактиновый комплекс

5.3.2. Фосфорилирование pl50Glued киназой LOSK не влияет на активность
динеинового транспорта в клетке
5.3.3. Ингибирование LOSK нарушает внутриклеточный транспорт на
длинные дистанции
5.3.4. Фосфорилирование белка pl50Glued протеинкиназой LOSK
определяет его центросомную локализацию
5.4. Регуляция центросомпой локализации РСМ-1 посредством LOSK
5.4.1. Ингибирование LOSK вызывает перераспределение центросомного
белка РСМ-1 в цитоплазму
5.4.2. Нарушение естественной локализации pl50Glued в клетках ведёт к
истощению центросомного пула РСМ-
5.4.3. Нарушение радиальной системы микротрубочек приводит к
снижению содержания РСМ-1 на центросоме до уровня, наблюдаемого при ингибировании LOSK
5.4.4. Ингибирование LOSK, сопровождаемое потерей центросомной
локализации белком РСМ-1, не приводит к значительным нарушениям формирования первичных ресничек в клетках
5.5. Участие LOSK в организации микротрубочек на аппарате Гольджи
5.5.1. Выбор клеточной модели для изучения организации микротрубочек
посредством аппарата Гольджи
5.5.2. В клетках, использующих аппарат Гольджи в качестве ЦОМТа,
активность LOSK незначительно влияет на организацию микротрубочек
5.6. Регуляция клеточной подвижности протеинкиназой LOSK
5.6.1. Выбор экспериментальной модели для изучения миграции клеток.
Ингибирование LOSK приводит к нарушениям клеточной миграции
5.6.2. Точечная мутация RhoA в сайте фосфорилирования киназой LOSK приводит к изменению подвижности клеток
5.6.3. Генетические конструкции, кодирующие GFP-слитые RhoA, обладающие различной активностью, по-разному влияют на клеточную подвижность
5.6.4. Имитирующая фосфорилирование RhoA восстанавливает скорость,
но не направленность движения клеток на фоне ингибирования LOSK
5.6.5. Имитирующий фосфорилирование pl50Glucd способен частично
восстанавливать направленность движения клеток
5.6.6. Ингибирование LOSK или экспрессия RhoA-S188A изменяют
морфологию актинового цитоскелета
5.6.7. Ингибитор RhoA-зависимой киназы pl60ROCK восстанавливает
параметры клеточной подвижности на фоне ингибирования LOSK
5.6.8. Поляризация аппарата Гольджи в клетках зависит от активности
RhoA. RhoA-S188E восстанавливает поляризацию АГ при ингибировании LOSK
5.6.9. Способность клеток к направленной миграции не зависит от
состояния системы микротрубочек, регулируемого LOSK
6. Обсуждение результатов
7. Заключение
8. Выводы
9. Список сокращений
9.1. Названия белков
10. Список цитируемой литературы
11. Приложение. Дополнительный иллюстративный материал..
1 1 1 п п ui rmmra
цепь миозина по Thrl8 и Seri 9, что является одним из определяющих моментов для образования акто-миозинового сократительного кольца и последующего прохождения цитокинеза. Однако, киназа ROCK способствует более эффективной активации миозина, воздействуя также через активацию MLCK и инактивацию фосфатазы миозина (Riento and Ridley, 2003; Yamashiro et al., 2003). Во время же миграции клеток малая ГТФаза RhoA активируется на заднем крае клетки, воздействуя, в первую очередь, на киназу ROCK, которая вместе с MLCK участвует в сборке стресс-фибрилл, обеспечивающих сократительную силу для движения клетки (Riento and Ridley, 2003).
Связь между RhoA и цитоскелетом является сложной и двунаправленной. Известно, что при разборке актиновых стресс-фибрилл цитохалазином D происходит активация RhoA; интересно, что тот же эффект наблюдается при деполимеризации микротрубочек колхицином (Ren et al., 1999). Возможно, это связано с тем, что микротрубочки задействованы в регуляции активности малых ГТФаз Rho и Rac через фактор GEF-Hl (Krendel et al., 2002), который инактивируется при секвестрировании его Tctex-1 - лёгкой цепью связанного с микротрубочками динеинового комплекса. Высвобождение GEF-H1 ведёт к активации RhoA и образованию актиновых стресс-фибрилл (Meiri et al., 2012). С другой стороны, RhoA может способствовать стабилизации микротрубочек через её эффектор mDia (Palazzao et al., 2001). Привлекаемый к плюс-концам Glu-микротрубочек белками ЕВ1 и АРС (adenomatous polyposis coli), mDia способствует накоплению стабильных микротрубочек на ведущем крае движущейся клетки (Wen et al., 2004). С другой стороны, избыточная активация RhoA опосредует чрезмерную стабилизацию микротрубочек, приводящую в итоге к нарушению их организации (Grigoriev et al., 2006).
Очевидно, что регуляция активности малой ГТФазы RhoA представляет собой очень сложный процесс, в котором фигурирует множество участников. Отдельную группу представляют протеинкиназы, субстратом для которых является RhoA. Достаточно давно было установлено, что цАМФ- или цГМФ-зависимые киназы фосфорилируют белок RhoA по серину 188 (Lang et al., 1996; Sauzeau et al., 2000), что приводит к связыванию этого белка с GDI (guanine dissociation inhibitor) и препятствует встраиванию RhoA в мембрану клетки (Forget et al., 2002). Интересно, что такое ингибирование активности RhoA защищает этот белок от протеосомной деградации (Rolli-Derkinderen et al., 2005), которая может запускаться при убиквитинировании RhoA убиквитин-лигазой Smurfl (SMAD specific ЕЗ
ubiquitin protein ligase 1), активирующейся на переднем крае клетки (Wang et al., 2003). Вероятно, сохранение временно инактивированной RhoA необходимо для её быстрого высвобождения и активации при определённых стимулах.