Активация АТМ/ATR-сигнального пути в эмбриональных стволовых клетках после повреждения ДНК

• Автор: Суворова, Ирина Игоревна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 110 с. : ил.

Оглавление

Список используемых сокращений

Актуальность проблемы

Цели и задачи исследования

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Эмбриональные стволовые клетки

1.1 Происхождение и основные свойства ЭСК

1.2 Сигнальные пути, участвующие в регуляции самообновления и

плюрипотентности ЭСК

1.3 Транскрипционные маркеры плюрипотентности

1.4 Структура клеточного цикла ЭСК

2. Активация ATM/ATR-сигнального пути в клетках после повреждения ДНК
2.1. Общая схема активации ATM/ATR-сигнального каскада
2.2. Распознавание повреждений ДНК и формирование репаративных фокусов
2.3. Активация контрольных точек клеточного цикла в фазах G|/S, S и G2/M после
повреждения ДНК
2.4. Регуляция белка р53 и его роль в клеточном ответе на повреждение ДНК.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Культивирование клеток
МТТ-тест
Проточная цитофлуориметрия на содержание ДНК
Анализ активности каспаз in vitro
Иммунофлуоресценция
Электрофорез и иммуноблоттинг
Выделение РНК и ОТ-ПЦР
РЕЗУЛЬТАТЫ
Активация киназ ATM и ATR в ЭСК после повреждения ДНК
Колокализация фокусов уН2АХ с белками RAD51, DNA-PK и 53ВР1 после облучения в

Влияние ингибиторов киназ ATM, ATR, Chkl, Chk2 на распределение мЭСК по фазам
клеточного цикла и выживаемость клеток
Влияние ингибиторов киназ ATM, ATR, Chkl, Chk2 на распределение чЭСК по фазам
клеточного цикла
Активация сигнального пути p53-p21/Wafl в ЭСК после повреждения ДНК
Функциональные последствия активации белка р53, вызванной облучением, на
плюрипотентные свойства мЭСК
Последствия нутлин-зависимой активации белка р53 на плюрипотентные свойства

ОБСУЖДЕНИЕ
Активация киназ ATM и ATR и последующее формирование репаративных фокусов в
ЭСК после повреждения ДНК
Роль киназ ATM, ATR, Chkl и Chk2 в распределении ЭСК человека и мыши по фазам
клеточного цикла
Функциональный статус сигнального пути p53-p21/Wafl в ЭСК после повреждения

Функциональные последствия активации р53 на плюрипотентные свойства мЭСК
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Список цитированной литературы

Список используемых сокращений
ATM ataxia telangiectasia mutated
ATR ataxia telangiectasia and Rad3-related protein
ASK1 apoptosis signal-regulating kinase
ВМР4 bone morphogenetic protein
BRCA breast cancer
53ВР1 p53-Binding Protein
BRCT BRCA-1 C-terminus
CDK cyclin-dependent kinase
Chkl checkpoint kinase
Chk2 checkpoint kinase
DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole
DMSO dimethylsulfoxide
DNA-PK DNA-dependent protein kinase
ERK extracellular signal-regulated kinase
FGF fibroblast growth factor
GAPDH rjiHuepajibflerHfl-3-(J)oc4)aTflerHflporeHa3a
GDF growth differentiation factor
HDAC hystone deacetylase
Hdm2 human double minute
HR homologous recombination
IF6 interleukin
JAK Janus-associated kinase
Klf Kriippel like factor
FIF leukemia inhibitory factor
FIFR FIF receptor
МАРК mitogen-activated protein kinase
MDC1 mediator of Damage Checkpoint protein
Mdm2 mouse double minute

MEK mitogen activated protein kinase kinase
Mrell meiotic recombination
Mytl myelin transcription factor
NBS1 nijmegen Breakage Syndrome
NHEJ non-homologous end joining
p-TEFb positive transcription elongation factor b
PBS phosphate buffer solution
PIKK phosphatidylinositol 3-kinase-related kinases
PCNA proliferating cell nuclear antigen
PI3K phosphoinositide 3-kinase
Rb retinoblastoma protein
RPA replication protein A
Sox2 SRY-related high-mobility group (FlMG)-box-
STAT signal transducer and activator of transcription
Tbx3 T-box transcription factor
Tcf T cell-factor
Tell T-cell leukemia oncogene
TGFp transforming growth factor p
Trim28 Tripartite motif-containing
XRCC4 X-ray repair cross-complementing protein
BKM внутренняя клеточная масса
MTT метилтиазолилдифенил-тетразолиум бромид
ЭКК эмбриональные карциномные клетки
мЭСК эмбриональные стволовые клетки мыши
чЭСК эмбриональные стволовые клетки человека
ОТ-ГТЦР обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной реакцией

и Chk2 киназ, что приводит к его активации и разрушению комплекса р53 и MDM2. В нормальных условиях ассоциация с убиквитин-лигазой MDM2 приводит к протеосомной деградации р53. Активация р53 приводит к началу транскрипции ряда генов, среди которых центральную роль в поддержании G| блока играет ген p21/Wafl, белковый продукт которого способен связывать и ингибировать Cdk2/CyclinE комплекс (Kastan and Bartek, 2004). Белок p21/Wafl также связывает Cdk4(6)/CyclinD комплекс, предотвращая фосфорилирование Rb. Фосфорилирование белка RB необходимо для освобождения транскрипционного фактора E2F, который требуется для транскрипции генов S-фазы и последующему переходу клетки из G] в S фазу.
Считается, что остановка в фазе S, индуцированная появлением двунитевых разрывов, может осуществляться двумя путями. Первый путь, как описано выше, включает активацию сигнального каскада ATM/ATR-Chk2/Chkl и последующее убиквитинилирование и протеосомную деградацию фосфатазы Cdc25A (Zhao et al., 2002). А второй через активацию ATM вовлекает белок SMC1, компонент когезина, который необходим для правильной регуляции репликации ДНК. Однако точный механизм, посредством которого SMC1 функционирует в S фазе, запуская блок клеточного цикла, остается не ясным.
Существование контрольной точки в фазе G2 предотвращает вхождение
в митоз клеток с поврежденной ДНК. Ключевой мишенью в механизме
остановки клеточного цикла в этой фазе является циклин-зависимая киназа
Cdc2, активация которой происходит после соединения с циклином В1 и
нескольких фосфорилирований и дефосфорилирований. Для вхождения
клетки в митоз необходимо удалить фосфорные остатки с Туг15 и Thrl
киназы Cdc2, добавленные ранее киназами Weel и Mytl, соответственно
(Booher et al., 1997). В результате активация сигнального пути ATM/ATR-
Chk2/Chkl будет приводить к активации и стабилизации р53, который
регулирует транскрипцию белков p21/Wafl и 14-3-3. Последний связывается
с комплексом Cdkl/CyclinB и изолирует его в цитоплазме. Белок p21/Wafl