Физиологические процессы в периферическом вкусовом органе. Механизмы электрогенеза, возбудимости и афферентной нейропередачи

• Автор: Романов, Роман Александрович
• Шифр специальности: 03.01.02
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 215 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ.
I. ВВЕДЕНИЕ
И. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
II. 1. Организация периферического вкусового анализатора
11.1.1. Устройство периферического вкусового рецепторного органа
11.1.2. Морфологический и функциональный анализ клеток вкусовой почки
11.1.3. Электрофизиологический анализ клеток вкусовой почки. Поиск критериев для идентификации вкусовых клеток
11.2. Рецепторы вкусовых клеток. Трансдукция вкусовых стимулов,
ОПОСРЕДОВАННАЯ СИСТЕМОЙ ВТОРИЧНЫХ МЕССЕНДЖЕРОВ
11.2.1. Трансдукция горьких и сладких стимулов. Вкусовые рецепторы T1R и T2R
11.2.2. Роль фосфоинозитидного каскада в трансдукции горького, сладкого и умами. Внутриклеточные каскады в микровиллярных и цилиарных хемосенсорных клетках. 18 П.2.3.Ролъ IPЗ-зависшюго выхода кальция из внутриклеточных депо в трансдукции вкусовых стимулов
11.2.4. Роль гастдуцина во вкусовой трансдукции
11.3. Ионные каналы вкусовых клеток
11.3.1. Ионные каналы как детекторы вкусовых стимулов
11.3.2. Потенциал-зависимые ионные каналы вкусовых клеток
11.4. Первичные медиаторы. Методы и подходы для исследования секреции
11.4.1. Иммуноцитохимические методы и биохимические методы анализа клеточного содержимого
11.4.2. Жидкостная хроматография на микроколонках, капиллярный электрофорез.
11.4.3. Микродиачиз и медленно текущая двухтактная перфузия
11.4.4. Микроэлектродная волътамперометрия
П.4.5.Энзиматические биосенсоры
11.4.6. Клеточные биосенсоры
11.5. Межклеточные коммуникации во вкусовой почке
11.5.1. Первичные мессенджеры во вкусовой почке
11.5.2. АТФ как афферентный вкусовой нейромедиатор
11.5.3. Выброс АТФ
III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
III. 1. Выделение вкусовых клеток
111.2. Культура клеток и трансфекция
111.3. ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭКСПЕРИМЕНТЫ
111.4. Мониторинг внутриклеточного кальция (Ca-imaging)
111.5. Клеточные биосенсоры для АТФ и серотонина. Поиск и получение
111.5.1. Клеточные сенсоры на основе эндогенныхpeifenmopoe
111.5.2. Клеточный сенсор к АТФ на основе экзогенных рецепторов
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
IV. 1. Идентификация вкусовых клеток
IV. 1.1. Идентификация вкусовых клеток на основе электрофизиологических
критериев
IV. 1.2. Определение морфофункционалъных клеточных типов, соответствующих
электрофизиологически идентифицированным
IV. 1.3. Неинвазивная идентификация вкусовых клеток
IV.2. Функциональный анализ клеток типа
IV.2.1. Ионные каналы клеток Imima
IV.2.2. Чувствительность клеток 1 типа к АТФ, глутамату и ацетилхолипу.
Предполагаемая роль АТФ в паракрииной регуляции
IV. 2.3. Чувствительность клеток I типа к горькому
IV.3. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ КЛЕТОК ТИПА II
1V.3.1. Электрофизиологическая активность ионного канала TRPM5 в клетках II

IV.3.2. Клетки типа 11 высвобождают АТФ при стимуляции
IV.3.3. Клеточные механизмы афферентной нейропередачи. Роль потенциалов
действия
1V.3.4. Молекулярная природа АТФ-проницаемого канала клеток типа II.
Ингибиторы. Коннексины versus паннексин
1V.3.5. Роль митохондрий в афферентной нейропередаче
IV.4. Функциональный анализ клеток типа III
IV.4.1. Ионные каналы вкусовых клеток типа III
IV. 4.2. Роль потенциалов действия в кодировании информации. Афферентная
нейропередача
IV.4.3. Чувствительность клеток типа III к аминокислотам и кальцию. Функциональная экспрессия калъций-чувствующего рецептора
V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
VI. ВЫВОДЫ
VII. ПРИЛОЖЕНИЕ
VIII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
IX. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

I. ВВЕДЕНИЕ.
Современные представления о молекулярных механизмах вкусовой трансдукции практически полностью базируются на данных молекулярнобиологических исследований периферического вкусового органа и на системных физиологических данных, полученных с использованием генетически модифицированных животных (нокаутные (knock-out) и трансгенные мыши). Первые позволили идентифицировать во вкусовой ткани ряд потенциально важных сигнальных белков, а вторые (поведенческие эксперименты и регистрации электрической активности афферентных вкусовых нервов) позволили продемонстрировать ключевую роль ряда из этих белков в восприятии вкусовых стимулов той или иной модальности. В настоящий момент общепризнано, что следующие сигнальные белки играют основополагающую роль в трансдукции вкусовых стимулов - от распознавания во вкусовой поре до передачи информации на нервное окончание:
1) Два семейства гептаспиральных вкусовых рецепторов, включая примерно 30 рецепторов семейства T2R, распознающие горькие вещества, и три рецептора семейства T1R, формирующие один гетеродимерный рецептор сладкого (T1R2/T1R3) и один рецептор аминокислот (T1R1/T1R3).
2) Альфа субъединица G-белка гастдуцина (а-гастдуцин), фосфолипаза С (32, ионный канал TRPM5, knock-out каждого из которых приводит к снижению или даже полному подавлению чувствительности генетически модифицированных животных к горькому, сладкому и умами вкусам.
3) Канальные белки PKD2L1 и субъединицы эпителиального натриевого канала (ENaC). Генетический нокаут PKD2L1 приводит к снижению чувствительности животных к кислому, удаление альфа-субъединицы ENaC приводит к подавлению амилорид-зависимой компоненты соленого вкуса.
4) Р2Х2/Р2ХЗ-рецепторы, локализованные на нервных окончаниях, инервирующих вкусовую почку, knock-out которых приводил к полному исчезновению вкусовой чувствительности у мышей.
С использованием иммуногистохимии и гибридизации in situ был проанализирован профиль экспрессии вышеупомянутых белков в популяции
нервному волокну на большие расстояния, в частотном кодировании информации, синхронизации мышечного сокращения. В то же время вторичные сенсорный клетки, не имеющих аксонов, например фоторецепторы позвоночных и волосковые клетки органа Корти не используют ПД для кодирования и передачи сенсорной информации на последующие звенья клеточной цепи и даже не способны их генерировать. Поэтому удивительно было обнаружить, что вкусовые клетки амфибий проявляют электровоз будимые свойства (Roper, 1983). Более того, на данный момент неоспорим тот факт, что вкусовые клетки позвоночных, включая млекопитающих, генерируют ПД не только в ответ на электрическую стимуляцию, но также и в ответ на стимуляцию вкусовыми веществами апикальной (сенсорной) части вкусовых клеток (Behe et al, 1990; Avenet, Lindemann, 1991; Cummings et al, 1993; Varkevisser, Kinnamon, 2000; Yoshida et al, 2006).
Для генерации ПД вкусовым клеткам необходимо обладать рядом ионных каналов. Как сказано выше, такие ионные каналы (потенциалзависимые (ПЗ) натриевые, калиевые и кальциевые каналы) действительно функционируют во вкусовых клетках. Однако детальный анализ профиля функциональной экспрессии ионных каналов на идентифицированных вкусовых клетках был осуществлен лишь частично. Следует напомнить, что во вкусовой почке функционируют как минимум 3 типа рецепторных клеток: тип I (выполняющий поддерживающую функцию и рецепцию соленого), тип II (ответственен за рецепцию горького, сладкого и умами) и тип III (рецепция кислого).
Изучение свойств генерируемых ВРК потенциалов действия с использованием методов фиксации потенциала и фиксации тока (Chen et al., 1996), показало:
1) деполяризующий импульс при поддерживаемом потенциале -80 мВ вызывает генерацию ПД вкусовыми клетками. Пороговый потенциал приблизительно -35 мВ, входное сопротивление ВРК в среднем около