Молекулярно-генетический анализ и функционально значимые генетические мутации вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней

• Автор: Гребенникова, Татьяна Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 303 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Актуальность темы
Цель и задачи исследования
Научная новизна работы
Практическая значимость
Основные положения, выносимые на защиту
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Заболевание, вызываемое вирусом РРСС
1.2 Таксономическая характеристика вируса РРСС
1.3 Ультраструктура и морфогенез вируса РРСС
1.3.1 Репликация вируса in vivo и in vitro
1.3.2 Структура вириона вируса РРСС
1.4 Геномная организация вируса РРСС
1.5 Неструктурные белки вируса РРСС (белки репликативного
комплекса)
1.5.1 Неструктурные белки, кодируемые ORFla
1.5.2 Неструктурные белки, кодируемые ORF lb
1.6 Основные структурные белки вируса РРСС
1.6.1 Нуклеокапсидный (N) белок
1.6.2 Основные оболочечные белки
1.6.2.1 М белок
1.6.2.2 Главный поверхностный гликопротеин (GP5)
1.6.3 Минорные структурные белки вируса РРСС
1.6.3.1 Гликопротеин GP2
1.6.3.2 Гликопротеин GP4
1.6.3.3 Гликопротеин GP3
1.7 Геномная изменчивость вируса РРСС
1.7.1 Геномная изменчивость неструктурных белков
1.7.2 Геномная изменчивость главных негликозилированных
структурных белков
1.7.3 Геномная изменчивость главного оболочечного гликопротеина
1.7.4 Геномная изменчивость минорных вирусных гликопротеинов
1.8 Методы диагностики РРСС
1.9 Методы специфической профилактики РРСС
1.10 Применение методов обратной генетики для создания вирусов
с новыми свойствами

Изучение микроэлементных профилей металлов для характеристики физиологического состояния биологической
системы
Заключение по обзору литературы
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы и методы исследований
Результаты
Разработка методов диагностики РРСС
Исследование образцов, полученных из хозяйств России и Белоруссии, на наличие антител к вирусу РРСС с
использованием коммерческого набора ИФА
Разработка тест-системы на основе ПЦР для определения РНК
вируса РРСС
Исследование образцов, полученных из хозяйств России и
Белоруссии, на наличие вируса РРСС методом ПЦР
Разработка тест-системы на основе ПЦР в реальном времени
(“Real-time PCR”) для определения РНК вируса РРСС
Исследование генетической вариабельности белка нуклеокапсида с использованием филогенетического анализа... Разработка тест-системы ИФА для определения антител к
вирусу РРСС
Получение рекомбинантного белка нуклеокапсида в
прокариотической системе экспрессии
Получение рекомбинантного белка нуклеокапсида в
бакуловирусной системе экспрессии
Сравнительный иммунохимический анализ рекомбинантных
продуктов
Выявление и анализ геномных детерминант вирулентности
вируса РРСС
Исследование вирулентности трех различных вариантов
штамма NADC8 вируса РРСС
Определение и сравнительный анализ первичной структуры геномов трех различных вариантов штамма NADC-8 вируса РРСС. Выявление потенциальных детерминант вирулентности. Создание библиотеки полноразмерных инфекционных копий
генома аттенуированного штамма вируса РРСС
Получение плазмидного вектора, содержащего сайты множественного клонирования для получения полноразмерного вирусного генома

0 (Л w
2.2.3.2 Разработка стратегии сборки полноразмерной копии генома
аттенуированного штамма вируса РРСС в E.coli под контролем промотора фага Т7
2.2.4 Получение инфекционного вируса РРСС на основе его
рекомбинантного генома
2.2.4.1 Оптимизация процесса введения рекомбинантной геномной РЕЙС вируса РРСС, полученной in vitro в клетки перевиваемых клеточных линий ВНК-21 и MARC
2.2.4.2 Характеристика библиотеки плазмид, содержащих полноразмерный геном кДНК аттенуированного штамма
вируса РРСС, вирусологическими методами
2.2.5 Проведение микроэлементного анализа клеточной культуры MARC-145 до и после инфицирования штаммами вируса РРСС
различной вирулентности
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ И ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ

вируса РРСС из различных географических областей (Mardassi H. et al. 1994).
1.7.1 Геномная изменчивость неструктурных белков
Белки репликативного комплекса, кодируемые ORF la, имеют консервативные сайты в местах разрезания полипротеина и участках, кодирующих протеазы. Белок Nsp2 изменчив у различных артеривирусов, так у вируса РРСС штамма Lelystad его длина 861 а. о., у LDV - 733 а. о., у EAV -401 а. о., причем идентичность наблюдается только в N- и С-концевых доменах (de Vries et al. 1997). Центральный сегмент - изменчив не только для артеривирусов, но и для штаммов двух генотипов вируса РРСС. Изменчивость между двумя европейским и американским генотипами доходит у него до 68%. Наименее изменчивым является белок Nsp4, его вариабельность для двух генотипов составляет только 38%. Изменчивость остальных белков составляет от 41 до 47% (Allende R et al. 1999).
Относительно консервативным для штаммов Европы и Америки является участок псевдоузла (таблица 3). Идентичность американского и европейского генома в этой области составляет 98%. Область сдвига рамки является консервативной для вирусов РРСС. Этот семинуклеотидный участок UUUAAAC присутствует у американского штамма вируса 16244В в позициях 7689-7696, раньше на четыре нуклеотида, чем UAG-кодон (стоп кодон) для ORF 1а.
Белки, кодируемые ORF lb более консервативны, чем белки, кодируемые в ORF 1а (таблица 3). При этом N-конец полипротеина более консервативен, чем С-конец, 150 а. о. на С-конце имеют только 42% идентичности между двумя генотипами. Самый изменчивый из неструктурных белков, закодированных в ORF lb, - Nspl2 и его вариабельность составляет 58% для двух генотипов вируса РРСС.